Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-298
Main Title: Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Multienzyms Enniatinsynthetase
Translated Title: Studies on the structure and function of the multienzyme enniatin synthetase
Author(s): Doller, Anke
Advisor(s): Zocher, Rainer
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Doller, Anke: Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Multienzyms Enniatinsynthetase Enniatine haben vielfältige pharmakologische Eigenschaften und sind daher von hohem biotechnologischen Interesse. Diese Verbindungen gehören zur Klasse der Cyclodepsipeptide und werden nichtribosomal von einem Multienzym, der Enniatinsynthetase (ESYN) gebildet. Enniatine bestehen aus jeweils drei Molekülen der D-2-Hydroxyisovaleriansäure und einer N-methylierten L-Aminosäure. Diese Grundbausteine sind alternierend durch Peptid- und Esterbindungen verknüpft. Im Gegensatz zu anderen Peptidsynthetasen besitzt das Enzym nur zwei Reaktionsmodule (EA und EB), die Zweierbausteine synthetisieren, die in einem iterativen Prozess verknüpft werden. Ziel der Arbeit war es, durch den Einsatz biochemischer und molekularbiologischer Methoden weitere Erkenntnisse über die Struktur und Funktion dieses Enzyms zu erhalten. Ein Hauptpunkt der Untersuchungen bildete die funktionale Expression der Enniatinsynthetase. Als Expressionsorganismus wurde Streptomyces gewählt, da in diesem Organismus bereits eine ganze Reihe von Enzymen des Sekundärmetabolismus exprimiert wurden. Dazu wurde ein Konstrukt aufgebaut, welches das gesamte Gen der ESYN enthält. Da der Codongebrauch der Streptomyceten unterschiedlich zu dem von Fusarien ist, musste dieser N-terminal angeglichen werden. Der Aufbau des Konstrukts erfolgte in 7 Stufen in einem E. coli/ Streptomyces Shuttlevektor. Expressionsversuche in S. lividans blieben trotz intensiven Screenings erfolglos, ebenso in dem Depsipeptidproduzenten S. tsusimaensis. Der Grund könnte darin liegen, dass die positiven Transformanden sensitiv auf das entstehende Enniatin sind und dadurch nicht überleben. Deswegen wurden nur Transformanden gefunden, bei denen das Insert aus dem Vektor eliminiert wurde. Weiter wurde die molekulare Basis der Substraterkennung an zwei Enniatinsynthetasen unterschiedlicher Substratspezifität untersucht. Interessanterweise lässt sich die Spezifität durch die von Stachelhaus (1999, Chem. & Biol. 6: 493-505) und Challis (2000, Chem. & Biol. 7: 211-224) vorgeschlagenen Modelle nicht vorhersagen. Dies zeigt, dass die von bakteriellen Systemen abgeleiteten Modelle nicht ohne weiteres auf pilzliche Systeme übertragbar sind. Eine weitere Analyse des Enniatinsynthetasegens ergab im Gegensatz zu den bisher bekannten Peptidsynthetasen drei Kondensationsdomänen, die in einem iterativen Synthesemechanismus auch gefordert werden. Eine Kondensation wird für die Ausbildung der Peptidbindung benötigt, zwei weitere für die Elongation und finale Zyklisierungsreaktion. Dies ist eine weitere Bestätigung für den postulierten Mechanismus. Es konnte durch Cross-Linking-Experimente gezeigt werden, dass in der Enniatinsynthetase N- und C-Terminus dicht beieinander liegen, was darauf hinweist, dass die beiden Reaktionsmodule in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander liegen müssen. Dies konnte bereits durch die Ergebnisse des Epitop-Mapping mit monoklonalen Antikörpern postuliert werden.
Doller, Anke: Studies on the structure and function of the multienzyme enniatin synthetase Enniatins are cyclohexadepsipeptides and constitute a class of pharmacologically interesting compounds and are of high biotechnological interest. They are synthesized nonribosomally by the large multifunctional enzyme enniatin synthetase (ESYN) following a thiotemplate mechanism. Enniatins are composed of alternating residues of D-hydroxyisovaleric acid and a branched-chain N-methyl-L-amino acid linked by peptide and ester bonds. In contrast to other peptide synthetases ESYN is a two-module (EA and EB) enzyme, which catalyzes biosynthesis in an interative manner. The goal of the present work was to get more insight into the structure and function of ESYN by the use of biochemical and molecular biolological methods. The main focus of the studies was the functional expression of ESYN. Streptomyces was used as the host for expression, because in this organism several enzymes of secondary metabolism could already be expressed. Therefore a construct was made representing the whole ESYN gene. The codon usage of Streptomyces differs from that of Fusaria, so it had to be adapted at the N-terminus. The construction of the plasmid was done in 7 steps in a Escherichia coli/Streptomyces shuttle vector. Despite intensive screening, expression in S. lividans and in the depsipeptide producer S. tsusimaensis was unsuccessful. The reason for that might be the toxic effect of enniatin on positive tranformants. Thus, only transformants could be detected, where the insert had been eliminated. In a second part the molecular basis of substrate recognition on two different enniatin synthetases was examined. Interestingly , the value of the methods of Stachelhaus et al. (1999, Chem. & Biol. 6: 493-505) and Challis et al. (2000, Chem. & Biol. 7: 211-224) is limited for the identification of the amino acids activated. This shows that results obtained from bacterial models cannot be transferred to fungal systems. Further analysis of the enniatin synthetase gene revealed, in contrast to other known peptide synthetases, the existence of three condensation domains, necessary in an iterative mechanism of biosynthesis. One condensation domain is required for peptide bond formation, the two other domains are necessary for elongation and final cyclization, respectively. This is a further confirmation for the postulated iterative mechanism. Furthermore, it could be shown by cross-linking experiments, that the C- and N-terminus of ESYN as well as modules EA and EB are located close to each other. This was also postulated by the results of epitope-mapping using monoclonal antibodies.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-2005
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/595
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-298
Exam Date: 12-Jan-2001
Issue Date: 9-Jul-2001
Date Available: 9-Jul-2001
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Enniatin
Expression
Nichtribosomal
Peptidsynthetase
Streptomyces
Enniatin
Expression
Non- ribosomal
Petide synthetase
Streptomyces
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