Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5571
Main Title: Investigation of experimental cell lines and non-invasive online sensor technologies in a 3D bioreactor system for extracorporeal liver support therapy
Translated Title: Untersuchungen von experimentellen Zelllinien und verschiedenen nicht-invasiven online Sensortechnologien in einem 3D Bioreaktorkultursystem für die extrakorporale Leberunterstützung
Author(s): Richter, Marco
Advisor(s): Lauster, Roland
Zeilinger, Katrin
Referee(s): Lauster, Roland
Zeilinger, Katrin
Kurreck, Jens
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Liver transplantation is currently the only successful treatment to cure acute or acute-on-chronic liver failure. However, the number of patients waiting for a donor organ is constantly rising due to scarcity of organ donations. To overcome this bottleneck different bio-artificial liver technologies are under investigation, which may take over functions of the diseased liver until a suitable donor organ can be transplanted or the diseased liver has recovered and regained its functions. A drawback so far is the lack of an effective cell source compensating human liver functions in vivo during extracorporeal liver support therapy. To be used in extracorporeal liver support therapy, cells need to be available in sufficient numbers, and they should be of human origin to minimize immunologic complications and safety risks for the patient. In this study, a novel cell source and sensor-based online monitoring methods were investigated using a multi-compartment hollow-fibre bioreactor technology developed at the Charité in Berlin for application in clinical extracorporeal liver support therapy. In the first part of the study, the rat pancreatic progenitor cell line (AR42J-B-13) was investigated as a model cell source for use in the bioreactor system. The ability of B-13 cells to trans-differentiate to liver-like cells (B-13/H cells) and the maintenance of hepatic functions were determined by means of metabolic parameters in addition to gene expression and histological analyses. Experiments revealed successful trans-differentiation in the bioreactor system. Bioreactor cultures showed increasing liver-specific functions, namely production of albumin and urea as well as cytochrome P450 activity. In contrast, secretion of amylase, typical for undifferentiated B-13 cells, declined over the culture period. Metabolic observations were confirmed by data from gene expression and protein analysis. Immune histochemical staining showed the expression of hepatic markers (CYP2E1, albumin, CK18, CEBP-ß and MRP2) in B-13/H cells after hepatic trans-differentiation in the bioreactor system. In the second part of the study, the integration of multi-parametric sensors into the bioreactor system was investigated to allow for cell culture surveillance in real-time. For this purpose oxygen and pH sensors (PreSens-Precision Sensing GmbH), as well as ammonia sensors and impedance sensors developed by the cooperation partners CEA-Leti-France and Fraunhofer IBMT, respectively, were integrated in an analytical-scale bioreactor for evaluation. In order to evaluate the ability of sensor-based methods to detect cell injury, the toxic drug methapyrilene was applied to B-13/H cells trans-differentiated in the bioreactor system. Online measurement of ammonia concentrations showed results comparable to offline values measured in samples from the culture medium. However, further optimisation concerning sterilisation, sensitivity, minimization of noise detection and sensor leakage is needed before using the technology in clinical applications. Impedance measurement enabled safe, sensitive and non-invasive detection of changes in the culture condition with a distinct response to toxic stress. To evaluate the bio-artificial liver system in a clinical setting, primary porcine liver cells (ppL) were investigated in the bioreactor system. As a model for toxic plasma exposure during clinical liver support sessions, the effect of the hepatotoxic drug acetaminophen (APAP) was evaluated. The response of the cells to toxic drug exposure was successfully monitored by sensor-based measurements, confirming the results from B-13/H cultures. Based on the results a procedure for culture prediction and decision-making conceived for extracorporeal liver support in a clinical setting was established. In the third part of the work, an up-scaled version of the bioreactor system was used in a pilot study to investigate the efficiency of cell culture and sensor-based monitoring in a clinical setting. As a cell source the H-14 cells developed by the cooperation partner Newcastle University were used as an experimental human equivalent of the B-13 cell line. The results of the pilot study indicate the feasibility of sensor-based monitoring during cell culture in the large-scale bioreactor. However, additional work has to be conducted to ensure sufficient cell numbers and to optimize sensor techniques for extracorporeal liver support in clinical application. In conclusion, the B-13 cell line represents a suitable model cell source in combination with the four-compartment bioreactor system for in vitro and clinical research. The integration of non-invasive online sensors enables sensitive culture surveillance and culture prediction. Finally, the genetically modified HPAC cell line H-14 might be a vital step towards the establishment of a human cell source in sufficient quality and quantity for extracorporeal liver support.
Die Lebertransplantation stellt derzeit die einzige kurative Behandlungsmethode bei chronischen und akuten Leberversagen dar. Aufgrund des ständig steigenden Bedarfs bei gleichzeitigem Mangel an Spenderorganen versterben viele Patienten auf der Warteliste für die Transplantation. Dieser Engpass hat dazu geführt, dass verschiedene bioartifizielle Technologien entwickelt wurden, welche die Leberfunktionen temporär übernehmen können, um die Wartezeit bis zur Transplantation zu überbrücken bzw. die regenerative Fähigkeit der Leber bis zu ihrer Genesung zu unterstützen. Eine derzeitige Hürde ist in der Erschließung einer effektiven Zellquelle für die extrakorporale Leberunterstützungstherapie zu sehen. Diese sollte leberspezifische Funktionen ausüben, in ausreichend großen Mengen zur Verfügung stehen und von humanem Ursprung sein, um immunologische Komplikationen in der Klinik zu vermeiden. In dieser Studie wurden eine neuartige Zellquelle, sowie sensorbasierte Methoden zur Echtzeitüberwachung von Funktionsparametern für die extrakorporale Leberunterstützung in einer an der Charité entwickelten 3D-Hohlfaser-Bioreaktortechnologie untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde als Modellzellquelle die aus Rattenpankreas stammende Vorläuferzellline AR42J-B-13 hinsichtlich ihrer Transdifferenzierung zu leberähnlichen Zellen (B-13/H Zellen) in dem 3D-Bioreaktorsystem untersucht. Der Differenzierungserfolg und der Erhalt leberspezifischer Funktionen wurden anhand des Metabolismus, der Genexpression und histologischen Analysen bestimmt. Die durchgeführten Experimente zeigten eine erfolgreiche Transdifferenzierung der B-13 Zellen mit einem Anstieg leberähnlicher Funktionen wie Albumin- und Harnstoffproduktion sowie Cytochrom P450-Enzymaktivitäten. Gleichzeitig konnte eine Abnahme der Amylasesekretion, charakteristisch für undifferenzierte B-13 Zellen, nachgewiesen werden. Dies konnte ebenfalls mittels Genexpression und Proteinanalyse bestätigt werden. Immunhistologische Färbungen zeigten eine Expression leberspezifischer Proteine (CYP2E1, Albumin, CK18, CEBP-ß und MRP2) in dem Bioreaktorsystem nach erfolgter hepatischer Transdifferenzierung. Ein weiteres Ziel dieser Studie war die Integrierung eines sensorbasierten Online-Detektionssystems zur Überwachung des Zellverhaltens, sowie deren Funktionalität und Vitalität in der 3D-Bioreaktorkultur. Zu diesem Zweck wurden Sauerstoff- und pH-Sensoren (PreSens-Precision Sensing GmbH) sowie von den Kooperationspartnern CEA-Leti-France und Fraunhofer IBMT entwickelte online Sensoren für Ammoniak- und Impedanzmessungen in einer Laborvariante des Bioreaktorkultursystems untersucht. Zur Analyse der Effektivität und Sensitivität der Sensoren wurde durch Zugabe der toxischen Substanz Methapyrilen ein Zellstress induziert. Der integrierte Ammoniaksensor zeigte gute Übereinstimmungen mit Werten aus offline gemessenen Proben. Jedoch zeigte sich ein Verbesserungsbedarf für die klinische Anwendung hinsichtlich des Sterilisationsverfahrens, der Sensitivität und der Sensordichtigkeit. Der Impedanzsensor ermöglichte eine sichere, sensitive und nicht-invasive Detektion und konnte die aktuellen Zellkonditionen aufzeigen. Für die Evaluierung des bioartifiziellen Lebersystems unter kliniknahen Bedingungen wurden primäre porzine Leberzellen verwendet. Als Modell für die Perfusion mit toxischem Plasma wurde der Effekt des hepatotoxischen Medikamentes Acetaminophen untersucht. Die induzierte Toxizität konnte erfolgreich mittels integrierter Sensoren identifiziert werden und bestätigte die Ergebnisse der zuvor untersuchten B-13/H Zellkulturen. Auf der Basis der Ergebnisse konnte ein Schema erarbeitet werden, welches eine Prognose über die Kulturqualität im Bioreaktor ermöglicht und im Hinblick auf die klinische Anwendung eine zeitnahe Entscheidung über die klinische Anwendung des Systems ermöglicht. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine Pilotstudie zur Evaluierung der Zellkultivierung und der Online-Sensorsysteme in einer Bioreaktorvariante im Klinikmaßstab durchgeführt. Hierfür wurde die experimentelle H-14 Zelllinie verwendet, welche von der Universität Newcastle als humanes Äquivalent für die B-13 Zelllinie generiert wurde. Die Ergebnisse der Pilotstudie zeigten die Machbarkeit einer sensorbasierten Überwachung des Zellverhaltens. Jedoch sind noch weitere Experimente erforderlich, um eine ausreichende Zellmenge für die extrakorporale Anwendung sicherzustellen, sowie die Sensortechnologie zu optimieren. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass B-13 Zellen in Kombination mit dem Vier-Kompartiment Bioreaktorsystem eine geeignete Modellzelllinie für die in vitro oder klinische Forschung darstellen. Die Integration nicht-invasiver Online-Sensoren ermöglicht eine sensitive Überwachung der Zellkultur. Die genetisch modifizierte HPAC-Zelllinie H-14 könnte einen wichtigen Schritt zur Generierung einer humanen funktionellen Zellquelle in ausreichender Qualität und Quantität für die Anwendung zur extrakorporalen Leberunterstützung darstellen.
URI: http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/5984
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5571
Exam Date: 11-Jul-2016
Issue Date: 2016
Date Available: 15-Nov-2016
DDC Class: DDC::500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): 3D bioreactor culture
trans-differentiation
AR42J-B-13 cell line
B-13
rat pancreatic progenitor cells
liver-specific function
3D Bioreaktorkultur
Transdifferenzierung
AR42-B-13 Zelllinie
Rattenvorläuferzelllinie aus dem Pankreas
leberspezifische Funktion
Usage rights: Terms of German Copyright Law
Appears in Collections:Technische Universität Berlin » Fakultäten & Zentralinstitute » Fakultät 3 Prozesswissenschaften » Institut für Biotechnologie » Fachgebiet Medizinische Biotechnologie » Publications

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
richter_marco.pdf9.85 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


Items in DepositOnce are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.