Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5578
Main Title: Tumorzell-Stroma-Interaktionen beim Multiplen Myelom
Translated Title: Tumor-stroma interactions in multiple myeloma
Author(s): Berenstein, Rimma
Advisor(s): Blau, Igor-Wolfgang
Referee(s): Kurreck, Jens
Lauster, Roland
Blau, Igor-Wolfgang
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: de
Abstract: Multiple myeloma (MM) is a B-cell malignancy characterized by accumu- lation of malignant plasma cells (PC) within the bone marrow. Bone marrow mesenchymal stromal cells (BMMSCs) represent a crucial component of multiple myeloma (MM) microenvironment supporting its progression and proliferation. Alterations in bone marrow mesenchymal stromal cells of multiple myeloma patients (MM-BMMSCs) have become an important research focus. However, the role of alterations of MM-BMMSCs in the pathophysiology of MM is not clear. In this study, aberrations in MM-BMMSCs and their modification through interaction with MM cells should be analysed. MM-BMMSCs displayed a senescence-like state that was accompanied by an increased senescence associated ß-galactosidase activity (SAßGalA), a reduced number of colony-forming units, an accumulation of cells in S phase of the cell cycle and the overexpression of different microRNAs (miR-16, miR-223, miR-485-5p, miR-519d) and p21. MM-BMMSCs showed reduced expression of mitochondrial stress response protein SIRT3 and an increased mitochondrial DNA mass that was associated with a higher amount of reactive oxygen species compared to healthy donor BMMSCs (HD-BMMSCs). The overexpressed microRNAs miR-485-5p and miR-519d are located on DLK1-DIO3 and C19MC, respectively. Analyses revealed copy number accumulation and hypomethylation of both clusters. In vitro interaction with MM cells decreased the SAßGalA of MM-BMMSCs in correlation with the reduction of p21 and cells in S phase of the cell cycle. MiR-485-5p was significantly decreased in co-cultured MM-BMMSCs in connection with an increased methylation of DLK1-DIO3. Modification of miR-485-5p levels using microRNA mimic or inhibitor altered senescence and cell cycle characteristics of MM-BMMSCs. Cell contact to MM cells induced increased expression of SIRT3 associated with reduced levels of reactive oxygen species in MM-BMMSCs. Co-cultured MM-BMMSCs displayed an increased level of monocarboxylate transporter MCT1/CD147, whereas co-cultured MM cells showed a higher level of MCT4/CD147. In this context, interaction between MM-BMMSCs and MM cells led to the exchange of lactate, which was inhibited by treatment of co-cultures with MCT inhibitor alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (alpha-CN). This induced apoptosis in MM cells and suppressed the increase of SIRT3 as well as the reinforced activation of NF-kappaB in MM-BMMSCs. Inhibition of SIRT3 in HD-BMMSCs using siRNA induced increased SAßGalA and a higher level of reactive oxygen species. Furthermore, knock-down of SIRT3 led to the accumulation of HD-BMMSCs in S phase of the cell cycle. MiR-223 expression in MM-BMMSCs was reduced by the presence of MM cells in vitro in a cell-contact dependent manner. Co-cultivation of MM cells and MM-BMMSCs induced activation of notch amongst others via jagged-2/notch-2 leading to increased expression of Hes1, Hey2 or Hes5 in both cell types. Cultivation of MM-BMMSCs with increasing levels of recombinant jagged-2 reduced miR-223 and increased Hes1 levels in a concentration-dependent manner. Transient reduction of miR-223 levels increased VEGF and IL-6 expression and secretion by MM-BMMSCs and impaired their osteogenic differentiation potential. Inhibition of notch signaling induced apoptosis in both MM cells and MM-BMMSCs. Furthermore, it increased miR-223 levels and reduced the expression of VEGF and IL-6 by both cell types. MM-BMMSCs show constitutive alterations in vitro resulting in a senescence-like state. MM cells modulate multiple pathways in senescence-like MM-BMMSCs leading to a better viability. SIRT3 and the DLK1-DIO3 cluster seem to influence the senescence-like state of MM-BMMSCs. Modulation of this phenotpye by MM cells can be reduced by treatment of co-cultures with MCT inhibitor alpha-CN. It is questionable whether the senescence-like state of MM-BMMSCs plays a pathological role in active MM or is more important for the promotion of a relapse. MiR-223 seems to participate in different MM supporting pathways in MM-BMMSCs including regulation of cytokine secretion as well as osteogenic differentiation. Further in vivo analysis regarding the role of the senescence-like state of MM-BMMSCs and of miR-223 for the support of MM could provide starting points for a more efficient anti-myeloma treatment.
Das Multiple Myelom (MM) ist eine B-Zellneoplasie, welche sich durch die Akkumulation maligner Plasmazellen im Knochenmark klinisch manifestiert. Mesenchymale Knochenmarkstromazellen sind eine essentielle Komponente der Mikroumgebung des MM und können die Tumorproliferation und -progression fördern. Die Untersuchung von Alterationen in Knochenmarkstromazellen von MM-Patienten (MM-BMMSCs) stellt einen Schwerpunkt in der Erforschung des MM dar. Allerdings ist der Einfluss dieser Alterationen auf die Pathogenese des MM nicht vollständig geklärt. In dieser Arbeit sollten Aberrationen in MM-BMMSCs und deren Beeinflussung durch die Interaktion mit MM-Zellen untersucht werden. MM-BMMSCs zeigten einen seneszenzartigen Zustand, welcher sich durch die erhöhte Aktivität der Seneszenz-assoziierten ß-Galactosidase (SAßGal), die verringerte Anzahl von „colony-forming units“, die Akkumulation der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus und die Überexpression verschiedener microRNAs (miR-16, miR-223, miR-485-5p, miR-519d) und p21 äußerte. Weiterhin war dieser Phänotyp von einer reduzierten Expression des mitochondrialen Stressproteins SIRT3, einer erhöhten Masse mitochondrialer DNA und einer erhöhten Menge an reaktiver Sauerstoffspezies im Vergleich zu BMMSCs von gesunden Spendern (HD-BMMSCs) begleitet. MiR-485-5p und miR-519d sind auf den zwei genomischen Clustern DLK1-DIO3 und C19MC lokalisiert. Analysen zeigten die Hypomethylierung und Kopieanzahlakkumulation von beiden Clustern in MM-BMMSCs. Die in vitro Interaktion mit MM-Zellen führte zur Erniedrigung der SAßGal-Aktivität, welche mit der reduzierten Expression von p21 und der Reduktion der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus assoziiert war. MiR-485-5p war signifikant reduziert in co-kultivierten MM-BMMSCs in Verbindung mit einer gesteigerten Methylierung der regulatorischen Region von DLK1-DIO3. Die Modifizierung von miR-485-5p über microRNA Mimikry und Inhibitoren beeinflusste die Zellzykluseigenschaften und den seneszenzartigen Phänotyp von MM-BMMSCs. Des Weiteren verursachte der Zellkontakt zu MM-Zellen die erhöhte Expression von SIRT3 und die Reduktion der reaktiven Sauerstoffspezies in MM-BMMSCs. Zudem konnte in co-kultivierten MM-BMMSCs ein gesteigertes Level des Monocarboxylat-Transporters MCT1/CD147 detektiert werden, wogegen in co-kultivierten MM-Zellen MCT4/CD147 erhöht wurde. In diesem Zusammenhang zeigten MM-BMMSCs und MM-Zellen einen Austausch von Laktat, welcher durch die Behandlung von Co-Kulturen mit dem MCT-Inhibitor alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (alpha-CN) inhibiert wurde. Dies führte zur Apoptose der MM-Zellen, verhinderte die Steigerung von SIRT3 und die erhöhte Aktivierung des NF-kappaB Signalweges in MM-BMMSCs. Die Inhibierung der SIRT3 Expression in HD-BMMSCs mittels siRNA verursachte eine Steigerung der SAßGal-Aktivität, sowie des Gehalts an reaktiver Sauerstoffspezies, und induzierte die Akkumulation der HD-BMMSCs in der S-Phase des Zellzyklus. Zusätzlich zeigte sich bei Co-Kultivierung mit MM-Zellen eine zellkontakt- abhängige Reduktion von miR-223 in MM-BMMSCs. Die Co-Kultivierung verursachte die Aktivierung des Notch-Signalweges in beiden Zelltypen unter anderem über eine Jagged2-Notch2-Interaktion. Diese führte zur erhöhten Expression der Notch-Targetgene Hes1, Hey2 oder Hes5 in beiden Zellfraktionen. Die Inkubation von MM-BMMSCs mit rekombinantem Jagged2 verursachte die konzentrationsabhängige Steigerung von Hes1 und gleichzeitig die Reduktion von miR-223. Die transiente Inhibierung von miR-223 erhöhte die Sekretion und Expression von IL-6 und VEGF und verschlechterte das osteogene Differenzierungspotential von MM-BMMSCs. Die Inhibierung der Notch-Signalisierung verursachte Apoptose in MM-Zellen und MM-BMMSCs und reduzierte die Expression und Sekretion von VEGF und IL-6 beider Zelltypen. Gleichzeitig wurde der Gehalt von miR-223 in MM-BMMSCs gesteigert. MM-BMMSCs zeigen konstitutive Veränderungen in vitro, welche in einem seneszenzartigen Zustand resultieren. MM-Zellen modulieren verschiedene Signalwege in seneszenzartigen MM-BMMSCs, welche die Vitalität der Zellen zu verbessern scheinen. SIRT3 und der DLK1-DIO3 Cluster könnten einen Einfluss auf den seneszenzartigen Phänotyp von MM-BMMSCs haben. Die Beeinflussung dieses Phänotyps durch MM-Zellen kann durch den MCT-Inhibitor alpha-CN reduziert werden. Es ist fraglich ob dieser Phänotyp für die Pathogenese des aktiven MM von Bedeutung ist oder vielmehr ein Rezidiv des MM fördern könnte. MiR-223 scheint eine wichtige Rolle für multiple, tumorfördernde Signalwege in MM-BMMSCs zu spielen. Hierzu zählt die Modifikation der Zytokinsekretion und der osteogenen Differenzierung von MM-BMMSCs.Weiterführende in vivo Analysen bezüglich der Rolle des Seneszenz-artigen Phänotyps von MM-BMMSCs und von miR-223 für die Unterstützung des MM könnten neue Ansatzpunkte für eine effizientere Therapie des MM aufzeigen.
URI: http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/5991
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5578
Exam Date: 31-Oct-2016
Issue Date: 2016
Date Available: 18-Nov-2016
DDC Class: DDC::500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): multiple myeloma
bone marrow mesenchymal stromal cells
miR-223
senescence
notch signalling
Multiples Myelom
mesenchymale Knochenmarkstromazellen
Seneszenz
Notch-Signalweg
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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