Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5733
Main Title: Tissue engineered cartilage: how hard can it be?
Translated Title: In-vitro hergestellter Knorpel: wie hart kann das sein?
Author(s): Kadler, Shirin
Advisor(s): Rosowski, Mark
Referee(s): Lauster, Roland
Duda, Georg
Rappsilber, Juri
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Für die Weiterentwicklung regenerativer Therapien sind humane in vitro Modelle aus Primärzellen entscheidend. Die Isolation und Expansion primärer Zellen zieht den Verlust der Gewebsspezifität nach sich. Diese Dedifferenzierung ist in allen Zellen des Mesenchyms zu finden und ist charakterisiert durch den Verlust der Expression von Gewebsmarkern und einer spindelförmigen Zellform durch Plastikadhärenz. Die Hypothese wurde aufgestellt, dass nach Abschluss der Dedifferenzierung der Zelltyp nur eine untergeordnete Rolle bei der de novo Herstellung eines Gewebes spielt. Ziel dieser Arbeit war es, ein in vitro Knorpelmodell zu erstellen. Für diesen Zweck wurden Chondrozyten sowie Adipozyten isoliert und in der Zellkultur expandiert. Nach der Kultivierung beider Zelltypen wurde die Dedifferenzierung auf mRNA Ebene untersucht. Überraschenderweise zeigen die dedifferenzierten Chondrozyten nach vielen Passagen immer noch eine hohe Expression von knorpelspezifischen Markern, während in Adipozyten kein Erhalt der Markergenexpression beobachtet wurde. Die Genexpressions-level von Sox5L, Sox6, Sox9 und Aggrecan waren selbst nach Differenzierung zu Osteoblasten und Adipozyten in den Chondrozyten von Arthrosepatienten erhalten. Für den Erhalt der Genexpression in Chondrozyten wurden epigenetische Mechanismen vermutet und daher die DNA-Methylierung untersucht. Eine Reduktion der Genexpression der verantwortlichen Methylase DNMT war in den Chondrozyten zu beobachten, was auf eine schrittweise DNA-Demethylierung durch Kultivierung hindeutet. Die Behandlung der dedifferenzierten Chondrozyten mit dem DNMT-Inhibitor 5-aza-dC zeiget keinerlei Veränderung der Markergenexpression. Überraschenderweise war jedoch die Fähigkeit der Chondrozyten, Knorpelmatrix zu produzieren, unterbunden. Die Differenzierung zu Osteoblasten und Adipozyten war jedoch nach der Stimulation mit 5-aza-dC verbessert. Im Widerspruch dazu steht die Untersuchung der DNA Methylierung. Trotz der vierwöchigen Behandlung mit 1 µM 5-aza-dC unterschieden sich die DNA Methylierungslevel global und an den untersuchten Positionen nicht von unbehandelten Zellen. Die 5-aza-dC Behandlung in dedifferenzierten Adipozyten zeigte für keine der durch-geführten Differenzierungen einen Effekt. Für die Adipozyten war nur ein schwaches Potenzial für die osteogene und chondrogene Differenzierung festzustellen. Für die Erstellung eines in vitro Knorpelmodells wurden daher ausschließlich dedifferenzierte Chondrozyten von Arthrosepatienten eingesetzt. Um möglichst viele Aspekte der in vitro Knorpelentstehung abzudecken, wurde der „CellWalker“ zur mechanischen Stimulation entwickeltet. Dies führte zu einer deutlichen Verbesserung der Knorpelmatrix. Der Elastizitätsmodul der Knorpelkonstrukte konnte auf diese Weise von 0,1 +/- 0,1 MPa auf 0,9 +/- 0,02 MPa gesteigert werden, was den Vorteil mechanischer Belastung auf stützgerüstfreie, lediglich zellbasierte 3D Knorpelkonstrukte belegt. Die Funktionalität der Knorpelkonstrukte wurde durch die Administration von IL1b demonstriert, durch welches die Arthrose imitiert wurde. Der Anstieg der Genexpression von Matrixmetalloproteinasen durch IL1b-Gabe wurde durch moderate mechanische Belastung aufgehalten. In frühen Phasen der Arthrose haben geringe Belastungen einen schützenden Effekt. Da nicht nur der Gelenkknorpel von der Arthrose betroffen ist, sondern ebenfalls der darunter liegende Knochen, wurde das Modell um diese Komponente erweitert. Hierbei wurde versucht, den Prozess der Endochondralen Ossifikation zu imitieren. Die Herstellung von Skelettelementen konnte in vorläufigen Versuchen demonstriert werden. In Kombination von Überbelastung und Zytokin-Stimulation soll nun die Anwendbarkeit dieses komplexen in vitro Konstruktes für das Krankheitsbild der Arthrose weiter getestet werden
In view of regenerative therapies, in the development of in vitro systems and disease models the utilization of primary human cells is desired and requested. All cells from connective tissue end up in a similar fibroblastoid cell type marked by loss of the specific expression pattern. It is still under discussion whether different de-differentiated mesenchymal cells have similar or identical differentiation capacities in vitro. The hypothesis was formulated that different de-differentiated cells of mesenchymal origin have comparable differentiation capacities in vitro. Specifically, the chondrogenic differentiation capacity of de-differentiated adipocytes and chondrocytes isolated from OA cartilage was investigated. Surprisingly, the chondrocytes used in this work were not affected by the loss of specific gene expression upon cell culture. The mRNA levels of Sox5L, Sox6, Sox9 and aggrecan remained unchanged. In contrast, isolated adipocyte forfeited their specific marker expression upon the artificial culture procedure. The underlying mechanisms of cartilage marker maintenance in OA chondrocytes were investigated with focus on the epigenetic modification by DNA methylation. Compared to direct isolated chondrocytes, the expression of DNA methyltransferases (DNMTs) was reduced in de-differentiated cells, indicating a reduction of DNA methylation levels in OA chondrocytes upon cell culture. The treatment of de-differentiated chondrocytes with the DNMT inhibitor 5-aza-2´-deoxycytidine (5-aza-dC) displayed no appreciable impact on the observed maintenance of marker gene expression, while the chondrogenic differentiation capacity was compromised. On the other hand, the pre-cultivation of 5-aza-dC improved the osteogenesis and adipogenesis of OA chondrocytes. Contradictory to these effects, the DNA methylation levels were not reduced after treatment with 1 µM 5-aza-dC for 4 weeks. The de-differentiated adipocytes showed weak osteoblastic and chondrogenic differentiation potential and the 5-aza-dC treatment was not able to enhance the differentiation disposition. Therefore de-differentiated chondrocytes were utilized to establish a reliable cartilage in vitro model. For this purpose, a special device to add mechanical strain to our model was constructed. By the application of the invented CellWalker system the cartilage differentiation was improved upon the mechanical stimulation. The Young´s modulus of in vitro cartilage was enhanced from 0.1 +/-0.1 MPa to 0.9 +/- 0.02 MPa proving the benefit of mechanical load on scaffold-free 3D cartilage constructs. In functionality studies, these 3D cartilage constructs showed enhanced matrix degeneration upon interleukin-1 beta administration, demonstrating the reliable fidelity of the in vitro culture system. On the other hand, a balanced mechanical perturbation could inhibit up-regulation of matrix degrading enzymes. This represents the protective effects of moderate mechanical stimulation in early phases of disease.  To improve the in vitro OA culture model, the bone tissue was included in the organoid structure. In preliminary experiments, a sequential differentiation strategy resulted in the formation of skeletal elements comparable to structures observed in the process of endochondral ossification. In prove of concept experiments, the initiation of osteoarthritis by overload in the absence or presence of cytokines will demonstrate the suitability of the complex culture system to serve as a cartilage disease model.
URI: http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/6168
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5733
Exam Date: 13-Jan-2017
Issue Date: 2017
Date Available: 21-Feb-2017
DDC Class: DDC::500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): cartilage
chondrocytes
DNA methylation
osteoarthritis
mechanical load
Knorpel
Chondrozyten
DNA-Methylierung
Arthrose
mechanische Belastung
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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