Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-330
Main Title: Verhalten von gentechnisch veränderten Mikroorganismen in Trink- und Flußwasserbiofilmen
Translated Title: Survival of genetically engineered micro-organisms in drinking and river water biofilms
Author(s): Hangen, Frauke Rena
Advisor(s): Szewzyk, Ulrich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Der gentechnisch veränderte Organismus (GVO) P. putida FH1 wurde aufgrund seiner Eigenschaft, Biofilme zu bilden und in Biofilmen zu wachsen, als Modellorganismus gewählt. Der Stamm enthielt das selbst-transferierende, mit dem Gen des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) markierte Plasmid pJB20. In Parallelexperimenten wurde der Wildtyp P. putida KT2442 eingesetzt. Beide Stämme konnten mit der neu-entwickelten 16S rRNA Sonde PPU646 spezifisch hybridisiert werden. In künstliche Biofilme aus Trinkwasserbakterien konnte sich P. putida FH1 nicht einlagern, während in ausgewählten Substraten eine enge Vergesellschaftung auch von P. putida KT2442 mit dem Trinkwasserisolat A. commune beobachtet wurde. In der mit Trinkwasser kontinuierlich durchströmten Robbins Device wurde P. putida KT2442 14 bzw. 28 Tage nach der Exposition frischer Polyethylen-Oberflächen inokuliert und konnte 27 bzw. 8 Tage in den Biofilmen detektiert werden. Die phylogenetische Zusammensetzung und Dichte der Biofilme veränderte sich in den 28 Tage alten Biofilmen signifikant. Als Medium mit höherer Substratkonzentration und Organismendichte wurde Wasser aus dem Landwehrkanal (LW-Wasser) verwendet. In nicht-sterilen Flüssigkulturen blieben P. putida KT2442 und P. putida FH1 über 200 Tage kultivierbar. Im Vergleich von stationären mit spät-logarithmischen Kulturen zeigten erstere keine Adaption an das LW-Wasser. Die Inkubation in LW-Wasser machte beide Organismen resistenter gegen Streß in Form von Gefrieren. Die Biofilmexperimente mit Landwehrkanal-Wasser wurden in 1l-Biofilmreaktoren im semi-batch Betrieb durchgeführt. P. putida KT2442 bzw. P. putida FH1 konnte durch spezifische in situ Hybridisierung mit der neuen Sonde PPU646 32 Tage, durch GFP-Expression 60 Tage und durch selektive Kultivierung 147 bzw. 183 Tage nachgewiesen werden. In bereits entwickelten Biofilmen lagerten sich P. putida KT2442 bzw. P. putida FH1 mit hoher Zellzahl an, gefolgt von einer zweistufigen Abnahme. Der Verlauf wurde übereinstimmend mit allen Detektionsmethoden gezeigt und weitgehend übereinstimmend für beide Organismen. Die Zugabe von P. putida KT2442 bzw. P. putida FH1 veränderte die LW-Biofilme nicht signifikant. Die Konjugation Rifampicin-resistenter Mutanten des Trinkwasserisolates A. citratiphilum mit P. putida FH1 unter Laborbedingungen ergab GFP-markierte Transkonjuganten. In den Flüssigkulturen mit LW-Wasser kam es zum Transfer des Plasmids pJB20 von P. putida FH1 auf autochthone, vorher unbekannte Spezies. Die Konjugationen wurden durch einen Antibiotika-Test, den immunologischen Nachweis des GFPs und die spezifische Amplifikation von auf dem Plasmid kodierten Genabschnitten bestätigt. Die Transkonjuganten wurden durch gruppenspezifische in situ Hybridisierung als beta-Proteobakterien klassifiziert und nach der Sequenzierung der jeweiligen 16 S rDNA als neue Spezies identifiziert.
The genetically engineered micro-organism (GEM) P. putida FH1 was chosen as model organism because of its ability to build and grow in biofilms. The strain contained the self-transmissible plasmid pJB20, which was tagged with the gene coding for the green fluorescent protein (GFP). The wild type strain P. putida KT2442 was used in parallel experiments. Both strains could be specifically hybridised with the newly constructed 16 S rRNA probe PPU646. P. putida FH1 could not integrate into artificial biofilms from drinking water bacteria, but in selected media a close association with the drinking water isolate A. commune was observed. P. putida KT2442 was added to a Robbins Device, which was fed with drinking water continuously, 14 and 28 days after fresh polyethylene surfaces were exposed, and could be monitored in the biofilms 27 and 8 days, respectively. The phylogenetic composition and the density of the 28 days old biofilms changed significantly due to the inoculation of P. putida KT2442. River water from the Landwehrkanal (LW-water) was then used as medium with higher concentration of substrate and organisms. In non-sterile batch-cultures both, P. putida KT2442 and P. putida FH1, stayed culturable over 200 days. No adaptation to the medium was found in stationary cultures compared to cultures from the late log-phase. Both organisms became more resistant against freezing through the incubation in LW-water. The biofilm experiments with LW-water were carried out semi-batch processed. P. putida KT2442 and P. putida FH1, respectively, could be monitored by specific in situ hybridization with the new probe PPU646 32 days, by expression of the GFP-gene for 60 days as well as by selective cultivation 147 and 183 days, respectively. Both, P. putida KT2442 and P. putida FH1, attached to established biofilms in high numbers, followed by a two-stage decrease of cell numbers. The curves corresponded for all methods of detection and were mostly corresponding between both strains. The biofilms from LW-water were not changed significantly by the addition of P. putida KT2442 or P. putida FH1. The mating of rifampicin resistant mutants of the drinking water isolate A. citratiphilum with P. putida FH1 under lab conditions resulted in GFP-tagged transconjugants. In batch cultures with LW-water as medium the plasmid pJB20 was transferred from P. putida FH1 to indigenous, formerly unknown river water bacteria. The conjugations were proven by antibiotic testing, immunological prove of the GFP and the specific amplification of gene sequences of the plasmid pJB20. Recipients were classified by 23 S rRNA directed group specific in situ hybridization and identified after sequencing of the 16 S rDNA.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-2322
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/627
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-330
Exam Date: 8-Mar-2001
Issue Date: 10-Jul-2001
Date Available: 10-Jul-2001
DDC Class: 620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten
Subject(s): Biofilm
Flußwasser
Gentechnisch veränderte Organismen
Grün Fluoreszierendes Protein
Pseudomonas putida
Trinkwasser
Biofilm
Drinking water
Genetically engineered microorganism
Green fluorescent protein
Pseudomonas putida
River water
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