Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-356
Main Title: Generation and Characterization of Free and Metal Associated Amino Acid Radicals in Ribonucleotide Reductase Using EPR Techniques
Translated Title: Erzeugung und Charakterisierung von freien und Metallassoziierten Aminosäure-Radikalen In Ribonukleotid-Reduktase Mittels EPR-Techniken
Author(s): Kolberg, Matthias
Advisor(s): Lassmann, Günter
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Ribonukleotid-Reduktase (RNR) ist für die Produktion von DNA-Vorläufern in allen bekannten Organismen verantwortlich. Die RNR-Proteine der Klasse I enthalten einen zweikernigen Eisen-Kofaktor, der nach einer Sauerstoffaktivierung ein stabiles Tyrosinradikal in der Proteinuntereinheit R2 erzeugt. Im Laufe des katalytischen Zyklus ist dieses Tyrosinradikal für die Erzeugung eines Thiylradikals in der Substratbindungstasche der Proteinuntereinheit R1 über eine Elektronen-Protonen-Transferkette verantwortlich. Bis heute wurde protein-assoziierte Thiylradikale weder in R1 noch in anderen Proteinen mit EPR beobachtet. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Methoden eingesetzt, um Thiylradikale in sowohl R1 als auch Modellsystemen künstlich zu erzeugen: (i) Photolyse durch UV-Bestrahlung, (ii) Thiol-Oxidation mittels CerIV, und (iii) Photolyse von nitrosylierten Thiolgruppen mit sichtbarem Laser-Licht. Die Radikale, die durch UV-Bestrahlung gefrorene Lösungen erzeugt wurden, wurden direkt mittels EPR bei tiefer Temperatur nachgewiesen, und konnten durch die Kombination der g-Faktoren und des stark anisotropen Relaxationsverhaltens des ungepaarten Spins, eindeutig identifiziert werden. Es handelt sich hierbei um die erste EPR-Charakterisierung von nicht-metallgekoppelten Thiylradikalen in einem Protein. Aufgrund der Überlagerung mehrerer Thiylradikale und g-"Strain" der breiten g
-Komponente, konnte das EPR-Spektrum am besten im Absorptionsmodus beobachtet werden. Die chemische Oxidation von Thiole mittels CerIV/ Nitrilotriessigsäure (NTA) oder die Laser-Photolyse von nitrosyliertem Cystein ermöglichen Radikalerzeugung bei Zimmertemperatur in flüssiger Lösung und sind daher für RNR-Aktivitätsstudien geeignet. In beiden Fällen haben EPR Spin-Trap-Versuche mit Phenyl-N-t-Butylnitron (PBN) und Kontrollen mit chemisch blockierten Cysteinen, gezeigt, dass die beobachteten Spinaddukte von Thiylradikalen stammen. Die EPR-Linienform der proteingebundenen Spinaddukten ist typisch für eine langsame Bewegung des Spinaddukts. Dies weist darauf hin, dass die Mehrheit der spinngetrapten Thiylradikale sich in den gefalteten, inneren Bereichen von R1 befinden. In aeroben R1-Proben ohne Spintrap, die nach der CeIV/NTA-Behandlung bzw. Laserphotolyse eingefroren wurden, wurden Sulfinylradikale (R S =O) beobachtet. Sulfinylradikale sind die Reaktionsprodukte von Sauerstoff und Thiylradikalen. Diese Experimente könnten als Grundlage für weitere Untersuchungen von proteinassoziierten Thiylradikalen dienen. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die Charakterisierung eines paramagnetischen Zentrums in der Mutante R2-Y122H des kleinen RNR Protein-Untereinheit. Diese Mutante wurde erzeugt durch eine Modifizierung an der Stelle des normalen Tyrosinradikals, um alternative Funktionen für die Sauerstoffaktivierung des Zwei-Eisen-Zentrums untersuchen. Das isolierte Protein enthält ein neuartiges ungewöhnlich stabiles Radikal mit einem isotropischen EPR-Signal, genannt Zentrum H. Die g-Tensoranisotropie dieses Zentrums konnte mittels Hochfeld-EPR bei W-Band aufgelöst werden. Die kleinste g-Tensorkomponente, die Temperaturabhängigkeit, sowie das Relaxationsverhalten deuteten auf ein metallassoziiertes paramagnetisches Zentrum mit einem S = ½ Grundzustand. In CW und Puls-ENDOR-Spektren von 57Fe-markiertem R2-Y122H, geben die zwei observierten 57Fe-hfs-Tensoren einen klaren Hinweis auf ein Zwei-FeIII-System, das wiederum zu einem dritten Spin gekoppelt sein muss, um einen S = ½ Grundzustand zu bilden. Die Puls-ENDOR-Spektren von Phe-d8-markiertem R2-Y122H liefern eindeutige Hinweise, dass dieser dritte Spin ein Phenoxylradikal in der Position F208. Diese Spektren konnten am besten unter der Annahme simuliert werden, dass ein Phenoxylradikal in der para-Position des F208-Phenylrings gebildet worden ist. Dies entspricht also einem Tyrosinradikal, das einen direkten Ligand zum Eisenzentrum bildet. Interessanterweise sind Hydroxylierungen in der meta-Position von F208 in anderen R2-Mutanten beobachtet worden. Hydroxylierung handelt sich um eine Zwei-Elektronen-Oxidation, ähnlich wie die katalytische Hydroxylierungsaktivität in dem strukturell verwandten Zwei-Eisen-Sauerstoff-Protein, Methan-Monooxygenase (MMO), wo z.B. Benzen in Phenol umgesetzt werden kann. Das langlebige paramagnetische Zentrum H in R2-Y122H stellt eine bislang unbekannte Möglichkeit für die Sauerstoffaktivierung des Zweieisenzentrums dar. Die Erzeugung eines Phenoxylradikals erfolgt durch eine Drei-Elektronen-Oxidation im Gegensatz zu der Hydroxylierungsreaktion in MMO und anderen R2-Mutanten. Wir haben gezeigt, dass die eingeführte Änderung in der Eisenumgebung zu einer neuartigen enzymatischen Funktion des Eisenzentrums geführt hat.
Ribonucleotide reductase (RNR) is responsible for the supply of precursors for DNA in every known organism. The class I RNR's contain a diiron cofactor, which generates a stable tyrosyl radical in the protein subunit R2 upon oxygen activation. During the catalytic turnover in RNR, the tyrosyl radical is postulated to generate a thiyl radical on a cysteine residue at the active site in the protein subunit R1 using a long-range electron-proton transfer chain. So far, no thiyl radical has been detected directly by EPR, neither in RNR, nor in fact, in any other protein. In this thesis, three methods are described for artificial generation of thiyl radicals in model systems, as well as in R1: (i) photolysis by UV irradiation, (ii) thiol oxidation using cerium(IV), and (iii) visual light photolysis of nitrosylated thiol groups. The radicals generated by UV irradiation of frozen solutions were detected directly by EPR at low temperature, and through the combination of the g-tensors and the strongly anisotropic relaxation behavior of the unpaired spin, the presence of thiyl radicals in R1 was confirmed. These are the first EPR characterizations of a non-metal-coupled thiyl radical in a protein. Due to the superposition of several thiyl radicals and g-strain, the broad g
component could be visualized favorably in the absorption display by integration of the first derivative EPR spectrum. The chemical oxidation of thiols by CeIV/nitrilotriacetate (NTA), and laser photolysis of nitric oxide (NO) from nitrosylated cysteines represent two methods for radical generation at room temperature in the liquid state, which may be suitable for RNR activity assays. In both cases, EPR spin trapping using phenyl-N-t-butylnitrone (PBN) and controls with chemically blocked cysteines, have shown that the observed spin adduct originates from thiyl radicals. The EPR lineshape of the protein-bound spin adduct is typical for slow motion of the nitroxide moiety, which indicates that the majority of trapped thiyl radicals are localized in a folded region of R1. In aerobic R1 samples without spin trap that were frozen after treatment with CeIV/NTA or laser photolysis, we observed sulfinyl radicals (R S =O) which are formed when thiyl radicals react with molecular oxygen. These experiments open the way for detection and characterization of protein-associated thiyl radicals. The second part of this thesis concerns the characterization of a paramagnetic center in the mutant R2-Y122H of the small RNR subunit. This mutant had been prepared to investigate alternate functions for the oxygen activation reaction of the diiron center by modifying the site of the normal tyrosyl radical. The purified protein containes an unknown unusually stable center with an isotropic EPR signal, termed center H. The g-tensor anisotropy of center H was resolved by high-field EPR at W-band. The smallest g-tensor value, the temperature dependence, as well as the relaxation behavior, pointed towards a metal-associated paramagnetic center with S = ½. From two 57Fe hfs-tensors observed in both CW and pulsed ENDOR spectra of a sample labeled with 57Fe, we obtained clear evidence for a diferric system, which however had to be coupled to a third spin to obtain the observed S = ½ ground state. From pulsed ENDOR spectra of R2-Y122H labeled with Phe-d8, we obtained significant evidence for a phenoxyl radical on residue F208. The best spectrum fit was obtained assuming a phenoxyl type radical at the C4-carbon of the phenyl ring, like a tyrosyl radical, directly ligated to the iron center. Interestingly, in other R2 mutants, hydroxylation at the C3-carbon of F208 has been observed. This is, however, a two-electron oxidation similar to the catalytic hydroxylation activity that is performed by another diiron-oxygen protein, methane monooxygenase (MMO), which can hydroxylate small hydrocarbons, e.g. benzene to phenol in vivo. Therefore, the long-lived paramagnetic center H in R2-Y122H, represents a previously not described possibility for such a diiron center since the formation of a phenoxyl radical involves a three-electron oxidation. This work has shown that an introduced perturbation of the surroundings of the diiron center leads to a distinctly new enzymatic function of the diiron center.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-2587
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/653
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-356
Exam Date: 24-Sep-2001
Issue Date: 17-Dec-2001
Date Available: 17-Dec-2001
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): ENDOR
EPR
Protein
Ribonukleotid-Reduktase
Thiylradikal
Zweieisenzentrum
Diiron center
ENDOR
EPR
Protein
Ribonucleotide Reductase
Thiyl radical
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