Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-360
Main Title: Multiparametric bioprocess monitoring based on automated fluorescence microscopy and image processing
Translated Title: Mehrparameter Analyse von Bioprozessen basierend auf automatischer Fluoreszenz-Mikroskopie und digitaler Bildverarbeitung
Author(s): Balzer, Andreas
Advisor(s): Leist, Christian
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Für die Bestimmung des physiologischen Zustandes von tierischen Zellkulturen die zur Produktion von Biopharmaka verwendet werden, wurde in dieser Arbeit ein System auf der Basis eines inversen Fluoreszenz Mikroskops in Kombination mit einer Färbeeinheit entwickelt, welches in der Lage ist die gesamte Probenvorbereitung automatisch durchzuführen (Zellfärbung, Befüllen der Durchflusszelle, Reinigung des Systems). Das entwickelte Gerät ist in der Lage sowohl die Anzahl lebender Zellen und die Vitalität der Zellen zu bestimmen, als auch die Morphologie der Zellen zu beschreiben, welches eine Abschätzung erlaubt, wann die untersuchten Zellen apoptotisch sterben. Es wurden in dieser Arbeit insgesamt zwei unterschiedliche Meßprinzipien bzw. Abtastverfahren entwickelt und implementiert. Das erste Verfahren, hier FullScan genannt, dient zur Routineüberwachung der Zellkultur und liefert Bilddaten von 100 verschiedenen Positionen der abgetasteten Durchflußzelle in drei unterschiedlichen Bildebenen. Aus diesen Daten können anschließend sowohl die Zellzahl wie auch die Vitalität und die morphologischen Veränderungen ermittelt werden. Das zweite Abtastverfahren genannt SnapScan dient dagegen mehr zur Klärung grundsätzlicherer Fragestellungen, wie der Messung des Anfärbeverhaltens einzelner Zellen. Dazu kann eine einzelne Position der Durchflußzelle über ein frei definierbares Zeitintervall in ein bis drei verschiedenen Bildebenen beobachtet werden. Die aufgenommenen Bilder können anschließend zu Video-Sequenzen zusammengesetzt werden, die ein schnelles Betrachten zeitlich langsamer Prozesse, wie das Eindringen eines Farbstoffes in die Zellen, in wenigen Minuten erlauben. Mit dem hier vorgestellten System ist es nun erstmals möglich, Proben vollautomatisch zu färben und unter dem Mikroskop zu analysieren. Im Gegensatz zu jeder manuellen Beobachtung ist das System Beobachter unabhängig und arbeitet zeitlich konstant. Die Ergebnisse von Untersuchungen in über 40 Fed-Batch und Batch Kultivierungen zeigen, das es mit dem hier entwickelten System möglich ist, den Kulturverlauf während der Kultivierung vollständig zu beschreiben. Die Analyse mehrerer optischer Ebenen liefert deutlich mehr Informationen, die auch in Zweifelsfällen eine richtige Einschätzung des Kulturverlaufes erlaubt, welches mit einer manuellen Färbung wie der Trypan-blau Färbung nicht immer möglich ist. Im Gegensatz zu anderen Methoden ist das in dieser Arbeit entwickelte Gerät in der Lage, ohne Hilfe eines Farbstoffes lebende Zellen durch Messung der Refraktion der Zellen, welche durch ihre Form und Struktur beeinflusst wird, direkt zu erkennen. Die Verwendung eines Fluoreszenz-Farbstoffes gewährleistet darüber hinaus eine zuverlässige Detektion auch der toten Zellen und zusätzlich können die morphologischen Veränderungen der Zellen quantifiziert werden. Das System wurde als Basis-Platform entwickelt und erlaubt z.B. eine schnelle Adaption an neue Färbeprozeduren. Die entwickelten Bildverarbeitungsalgorithmen sind parametrisierbar und können so schnell an neue Fragestellungen angepasst werden. Alle gemessenen Daten werden in Datenbanken gespeichert und erlauben so einen schnellen Vergleich einzelner Versuche.
The purpose of this work was to develop an automatic microscopy system (AMS) to monitor the physiological state of mammalian cells during the production of biopharmaceuticals. On the basis of an inverse fluorescent microscope, a device for liquid handling and staining, in combination with two computers for image processing and analysis, a system was developed that can automatically prepare and analyze samples, which come directly from a bioreactor. With the AMS, it was possible to determine the concentration of viable mammalian cells and their viability. Furthermore, the system is able to classify scanned cell samples based on their morphology and allows an assessment of whether a mammalian cell culture is entering the apoptotic pathway of cell death. During the course of the project, two different scan methods have been developed. The first scan method, referred to as FullScan , scans the developed flow-through-chamber in three different image planes at 100 positions. The second method, referred to as SnapScan , allows a time resolved scanning of the chamber at a single position. While FullScans were used predominately for routine observation of cells during cultivation, SnapScans were used to investigate the changes in cell-morphology and the capability of dye-uptake, as time-lapse studies. Subsequently, video-sequences of long-time studies were generated that allowed observation of dynamic processes lasting for hours in just minutes and which are normally too slow for a manual observation. Recording and analysis of different image planes at several chamber positions allow the determination of the physiological state of cells considerably better than can be done manually. The analysis of the out of focus image-plane of a FullScan, even makes it possible to recognize and count viable cells without any staining. In combination with a fluorescent dye to identify dead cells, a robust, objective, non-tiring and operator independent method has been developed. The results of fed-batch cultivations, examined by the AMS, showed that the system can describe the courses of cultivations far better than it can be done by an human operator using the manual trypan-blue exclusion method. The investigation of different image planes and the possibility to record time-resolved scans eliminates almost all problems of a manual staining method. In contrast to all other methods, the AMS can even differentiate unstained viable cells directly through their refraction behavior which changes with cell shape. Moreover, in combination with a fluorescent dye, the AMS ensures a considerably better detection of dead cells and can also quantify changes in the cell morphology. The present work allows for the first time the automatic analysis of cell samples by their optical properties in minutes. The system has been used in an industrial environment for the observation of more than 40 batch and fed-batch cultivations, thus emphasizing the robustness of the system. Moreover, the AMS has been constructed as a base-platform for fast adaption of new staining procedures and the developed image processing and analysis algorithms can easily be adjusted to new methods.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-2620
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/657
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-360
Exam Date: 28-May-2001
Issue Date: 14-Jan-2002
Date Available: 14-Jan-2002
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Bildverarbeitung
Morphologische Parameter
Multiparamter Analyse von Zellkulturen
Biotechnology
Cell culture
Image processing
Multiparametric bioprocess monitoring
Usage rights: Terms of German Copyright Law
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