Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6400
Main Title: Synthese von fluoreszierenden 7-Azatryptophan-Derivaten und deren Einbau in Modellpeptide
Subtitle: Untersuchung ihrer spektroskopischen und strukturellen Eigenschaften
Translated Title: Synthesis of fluorescent 7-Azatryptophan derivates and their incorporation into model peptides
Translated Subtitle: investigation of spectroscopic and structural properties
Author(s): Noichl, Benjamin Philipp
Advisor(s): Durkin, Patrick
Referee(s): Budisa, Nediljko
Kalesse, Martin
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: de
Abstract: In nature, proteins evolve to ensure the survival of living organisms in their natural environments. To equip them with new features and functions, classical protein engineering, based on canonical twenty amino acids, could lead to the improvement of these proteins by mutagenesis. Proteins sequences containing exclusively naturally occurring amino acids (i.e. canonical 20) are often unsuitable for solving anthropogenic and technologically interesting questions or challenges. Conversely, it is understood that protein chains can tolerate amino acid substitutions, since a protein only has a small number of canonical side chains that are crucial for its functional integrity and stability. This flexibility could therefore be used to deliver new synthetic amino acids in protein sequences and structures that confer new properties not found in naturally occurring proteins (e.g. altered enzyme-substrate specificities, resistance to organic solvents, unique chemical decorations, novel spectral windows, etc.). In this context, studying how the chemical modifications delivered by the incorporated non-canonical amino acids influence the structural integrity, conformational features and stability can provide insights into the mechanism of folding proteins and peptides with unnatural building blocks. This information is essential for analyzing the conditions under which secondary and tertiary structures develop, in addition to the design of stable bioactive peptides or peptide inhibitors. Therefore, the study of fluorescence spectroscopy is especially useful for examining the change in conformation in different structural and solvent contexts. This highly sensitive and precise method facilitates the investigation of electrostatic transition interactions within the model system. The canonical aromatic amino acids tryptophan, tyrosine, histidine and phenylalanine represent the simplest naturally occurring fluorophores. Tryptophan residue dominates fluorescence and as a result, the absorbance in proteins and replacement of these canonical aromatic amino acids does not lead to distinct spectral features. Moreover, the replacement of Trp → canonical aromatic amino acids might even lead to the perturbance of target protein structures due to differences in shape, size, dipole moments and even charge distributions between the scaffolds of these amino acids. To overcome these limitations, fluorescent, non-canonical amino acids which are isosteric to the natural tryptophan were designed. 7-Azatryptophan, a tryptophan analogue with an indole ring functionalized by the introduction of an endocyclic nitrogen atom at indole position 7 has been taken as a starting point for a chromophore design. The endocyclic modification only has a small steric influence on the side chain of the tryptophan, thus the spectroscopic properties are tailored so the chromophore can be monitored at wavelengths that exceed natural protein fluorescence. For example, the fluorescence maximum of tryptophan in most globular proteins falls in the range of 330 to 350 nm (depending on the solvent exposure of Trp residues). Our previous work on azatryptophans clearly indicated that these non-canonical fluorescent amino acids should typically show an excitation wavelength of about 300 to 350 nm and a specific red shifted emission wavelength between 400 and 500 nm. For all these reasons, various methylated 7-azatryptophan derivatives were prepared. The ring closure of the previously produced pyridine and alkyne building blocks by the palladium-catalyzed heteroanullation is a key step in the synthesis route, followed by their selective N-methylation. Using this synthesis route, the monomethylated, dimethylated and unmethylated 7-azatryptophan derivative were prepared successfully. As expected, the free amino acids with characteristic spectroscopic properties exhibited the desired changes in the absorption and emission profiles. Those differ for the various 7-azatryptophan derivatives depending on the degree of methylation. For example, the N methylation of the 7 azatryptophan lead to a striking STOKES effect of 128 nm when compared to tryptophan (79 nm). Synthetically prepared derivatives were incorporated into model peptides and all spectral features found within these substances in solutions were also present in model peptide sequences. This clearly indicates that the noncanonical 7 azatryptophan derivatives could be used as fluorescent labels. Unfortunately, their incorporation into hydrophobic cores of model peptides proved to interfere (to a larger or lesser extent) with folding and formation of the model peptides tertiary structure. On the other hand, their presence on scaffold surfaces is well tolerated. Another drawback includes lower quantum yields of the dimethylated and the unmethylated 7-azatryptophan that limits their use in natural structures containing indole side chains. Fortunately, the monomethylated 7-azatryptophan derivative is not subjected to these limitations and can readily be detected even in the presence of more than one tryptophan in the model peptide sequences that were studies.
Das klassische Feld des ‚protein engineering‘ basiert auf Verwendung von 20 kanonischen Aminosäuren mit deren Hilfe Proteine, durch die vorgenommene Mutagenese, mit neuen Funktionen und Eigenschaften ausgestattet werden können. Die Beantwortung von technischen und grundlegenden Fragestellungen wird allerdings deutlich erschwert, verwendet man lediglich die natürlich vorkommenden Aminosäuren zur Entwicklung von modifizierten Proteinen. Dabei ist bekannt, dass Proteinketten die Modifizierung von Aminosäuren tolerieren, da lediglich ein geringer Anteil der Seitenketten der kanonischen Aminosäuren für die korrekte Faltung und die Funktionalität verantwortlich ist. Diese Flexibilität ist Grundlage für den Einbau von neuartigen, synthetisch hergestellten Aminosäuren in Peptidsequenzen, um Strukturen und Funktionen zu erzeugen, die in natürlich vorkommenden Proteinen nicht existieren. Zu diesen Funktionen gehören u.a. Proteine die gegenüber organischen Lösungsmitteln inert sind, einzigartige chemische Seitenketten tragen, eine veränderte Enzym-Substrat Spezifität besitzen oder mit neuartigen spektroskopischen Eigenschaften ausgestattet wurden. In diesem Zusammenhang liefern Untersuchungen, in wie weit die eingeführten nicht kanonischen Aminosäuren die Struktur, die Konformation sowie die Stabilität beeinflussen, wichtige Einblicke in die Mechanismen die für die Faltung von Proteinen, verantwortlich sind. Diese Informationen sind für das grundlegende Verständnis, unter welchen Bedingungen sich Sekundär- und Tertiärstrukturen ausbilden sowie für die Entwicklung von stabilen bioaktiven Peptiden oder Peptid-Inhibitoren von großer Bedeutung. Eine sensitive Möglichkeit, die sich ändernde Konformation und die Triebkraft, die für die Wechselwirkung von Funktion und Stabilität verantwortlich ist, näher zu untersuchen, ist durch die Fluoreszenzspektroskopie gegeben. Diese Technik erlaubt es in Kombination mit ihrer hohen Präzision und Empfindlichkeit, die elektrostatischen Übergänge der wechselnden Interaktionen innerhalb des Modellsystems zu untersuchen. Zu den Einfachsten Vertretern der natürlich vorkommenden Fluoreszenz zählen dabei die aromatischen Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Wobei Tryptophan maßgeblich für die Absorption und Fluoreszenz in Proteinen verantwortlich ist und dessen Austausch durch die weiteren aromatischen Aminosäuren zu keiner eindeutigen Änderung in den Eigenschaften des Spektrums führt. Dieser Austausch würde durch die Veränderte Struktur, Größe und des Dipolmoments, der anderen aromatischen Aminosäuren, eher zu einer Störung der Struktur bzw. zu einer fehlerhaften Faltung führen. Um diese Restriktionen zu umgehen, besteht die Möglichkeit, fluoreszierende und sich zu den natürlich vorkommenden Aminosäuren isosterisch verhaltene, nicht kanonische Aminosäuren herzustellen. Dabei soll Tryptophan als Ausgangspunkt für die Weiterentwicklung eines Chromophors verwendet werden. Zu diesem Zweck wurde dessen Indol-Ring an Position 7 durch die endocyclische Einführung eines Stickstoffatoms und durch eine zusätzliche N-Methylierung funktionalisiert. Die endocyclische Modifikation hat nur einen geringen sterischen Einfluss auf die Seitenkette des Tryptophans und ist zudem in der Lage die spektroskopischen Eigenschaften zu modifizieren. In einem großen Teil der Proteine liegt das Emissionsmaximum von Tryptophan in einem Wellenlängenbereich von 330 bis 350 nm, abhängig davon in wie weit Tryptophan dem umgebenden Lösungsmittel ausgesetzt ist. Unsere vorangegangenen Arbeiten über Azatryptophane zeigten deutlich, dass die nicht kanonischen, fluoreszierenden Aminosäuren idealerweise eine charakteristische Absorption im Wellenlängenbereich von circa 300 bis 350 nm und ein spezifisches Emissionsmaximum im rot verschobenen Wellenlängenbereich zwischen 400 und 500 nm besitzen sollten. Aufgrund dessen wurden verschieden methylierte 7-Azatryptophan-Derivate hergestellt. Der Schlüsselschritt der Synthese erfolgt über den Ringschluss der zuvor hergestellten Pyridin- und Alkinbausteine mittels der Palladium-katalysierten Heteroanellierung, gefolgt von deren selektiven N-Methylierung. Mittels dieser Syntheseroute wurde erfolgreich das monomethylierte, das dimethylierte sowie das unmethylierte 7-Azatryptophan-Derivat hergestellt. Die Charakterisierung der spektroskopischen Eigenschaften der freien Aminosäuren zeigte die erwarteten Änderungen der Absorptions- und Emissionsprofile, die für die verschiedenen 7 Azatryptophan-Derivate, in Abhängigkeit des Grads der Methylierung, unterschiedlich stark ausgeprägt sind. So führen die durchgeführten N Methylierungen des 7 Azatryptophans zu einem prägnanten STOKES-Effekt von circa 128 nm und zu einer deutlichen Verschiebung zu längeren Wellenlängen des Emissionsmaximums um 57 nm, im Vergleich mit dem des Tryptophans. Nachfolgend wurden die hergestellten 7-Azattryptophan-Derivate in Modellpeptide eingebaut und zeigten in diesen dieselben spektroskopischen Eigenschaften, wie sie auch schon für die freien Aminosäuren in Lösung aufgezeichnet wurden. Dieses Verhalten beweist, dass die nicht kanonischen 7-Azatryptophan-Derivate als Fluoreszenzlabel Anwendung finden können. Der Einbau dieser Derivate in einen hydrophoben Kern des Modellpeptids stört allerdings den Faltungsvorgang und somit die Ausbildung einer Tertiärstruktur des Modellpeptids. Wohingegen deren Einbau an Positionen, die sich auf der Oberfläche des Proteins befinden, toleriert wird. Ein weiterer Nachteil sind die geringen Quantenausbeuten des dimethylierten und des unmethylierten 7-Azatryptophans, was deren Verwendung in Gegenwart von weiteren Indol-Seitenketten limitiert. Glücklicherweise unterliegt das monomethylierte 7 Azatryptophan-Derivat diesen Restriktionen nicht und lässt sich ohne Weiteres auch in Gegenwart von mehr als einem Tryptophan detektieren.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7091
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6400
Exam Date: 15-Sep-2017
Issue Date: 2017
Date Available: 4-Nov-2017
DDC Class: DDC::500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
Subject(s): Methylierte 7-Azatryptophan-Derivate
Fluoreszenz
methylated 7-Azatryptophan analogues
fluorescence
Trp-Cage
Beta-Hairpin
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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