Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6425
Main Title: Studien zur endogenen Expression von RNA G-Quadruplexen und deren Interaktion mit zellulären Proteinen
Translated Title: Studies on endogenous expression of RNA G-quadruplexes and their interaction with cellular proteins
Author(s): Serikawa, Tatsuo
Advisor(s): Kurreck, Jens
Referee(s): Kurreck, Jens
Rappsilber, Juri
Eberle, Jürgen
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: de
Abstract: Due to specific orientation of guanine molecules certain guanine-rich sequences can form inter- or intramolecular structures, known as Guanine (G)-quadruplexes (G4s or GQs). Over the last 10 years, it has been shown several times that RNA G-quadruplexes located in the 5´ UTR of the mRNA suppress translation, however, a recent study indicated that in eukaryotic cells RNA G-quadruplexes are globally unfolded. Under physiological conditions, the formation of RNA G-quadruplexes can be strongly regulated by interaction partners, such as helicases. Thus, the functional analysis of the RNA G-quadruplexes within the physiological and pathophysiological context is an exciting field of research. The present study describes the comprehensive captures of the cellular proteins which specifically bind to different RNA G-quadruplex motifs located in mRNAs of ARPC2, Bcl-2, MMP16 and NRAS, and hence can regulate the conformation of these secondary structures. Following metabolic labeling of proteins in the human cell line HEK293, RNA G-quadruplex binding proteins were detected using pull-down assays and LC-orbitrap mass spectrometry. Two different patterns of interactions for the RNA G-quadruplex motifs could be identified. While the RNA G quadruplexes of NRAS and MMP16 specifically interacted with a small number of proteins, those of Bcl-2 and ARPC2 exhibited a broader range of protein binding. Proteins identified in the present study are mainly involved in posttranscriptional and translational regulation and/or carcinogenesis. It is commonly accepted that RNA G-quadruplexes in the 5´ UTR of mRNAs show inhibitory effects on translation processes, however, it should be noted that this gene regulatory function has mainly been observed using reporter plasmid-based assays, so that the biological impact of the RNA G quadruplexes within the cellular system still remains unclear. In order to elucidate the functional relevance of RNA G-quadruplexes, a G-quadruplex disrupted cell line was generated by means of the CRISPR/Cas9 system. To this end, a G-quadruplex forming sequence of the anti-apoptotic gene Bcl-2 was mutated in the human melanoma cell line A-375. The Bcl-2 G-quadruplex disrupted cells showed no alternation of the endogenous Bcl-2 protein level, and consequently compared to wild type cells no increase in resistance to an apoptotic stimulus was observed. It is therefore conceivable that in previous studies G-quadruplexes were overexpressed in the transfected cells, resulting in an abnormal balance between the amounts of endogenous helicases and overexpressed G quadruplexes. As a consequence, the level of endogenous helicases was not sufficient to unwind the G-quadruplexes. Thus, the present study suggested that the genomic G-quadruplex in the 5´ UTR of the Bcl-2 mRNA is probably unfolded by its interaction partners, e.g. helicases and other proteins identified in the present study. All MS data are available from the ProteomeXchange Consortium via the PRIDE repository with identifier PXD005761.
Innerhalb der Nukleinsäure befinden sich Guanin-reiche Sequenzen, welche über die spezifischen Anordnungen von Guaninmolekülen inter- bzw. intramolekulare Strukturen ausbilden und als Guanin (G)-Quadruplexe, G4s oder GQs bezeichnet werden. Während der letzten 10 Jahre konnte mehrfach gezeigt werden, dass in der 5´-UTR der mRNA lokalisierte RNA G-Quadruplexe translationshemmend wirken, wohingegen kürzlich nachgewiesen wurde, dass RNA G-Quadruplexe in eukaryotischen Zellen in der Regel in nicht-gefaltetem Zustand vorliegen. Unter physiologischen Bedingungen kann jedoch die Ausbildung von RNA G-Quadruplexen durch Interaktionspartner wie Helikasen stark reguliert werden, so dass die funktionelle Analyse der RNA G-Quadruplexe innerhalb physiologischer bzw. pathophysiologischer Zusammenhänge ein spannendes Untersuchungsgebiet darstellt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine umfassende Identifizierung der zellulären Proteine, welche spezifisch an unterschiedliche RNA G-Quadruplexmotive in der 5´-UTR von ARPC2, Bcl-2, MMP16 und NRAS binden und somit die Ausbildung dieser Sekundärstruktur regulieren können, erfolgen. Durch metabolische Markierung der Proteine in der humanen Zelllinie HEK293 gefolgt von Pull Down Assays sowie die LC-Orbitrap Massenspektrometrie wurden RNA G-Quadruplex-bindende Proteine identifiziert. Innerhalb der verwendeten RNA G-Quadruplexe konnten zwei unterschiedliche Proteinbindungsmuster detektiert werden. Es zeigte sich, dass die RNA G-Quadruplexe von NRAS und MMP16 spezifisch mit wenigen Proteinen interagieren, während die von Bcl-2 und ARPC2 ein deutlich breiteres Spektrum an Proteinbindungen ermöglichen. Die hier identifizierten Proteine sind unter anderem an posttranskriptionellen und translationalen Regulationsmechanismen bzw. an der Karzinogenese beteiligt. Obwohl weitgehend von einem translationshemmenden Effekt der RNA G-Quadruplexe in der 5´-UTR der mRNAs ausgegangen wird, konnte diese genregulatorische Funktion meistens mittels Reporterplasmid-basierten Assays nachgewiesen werden, so dass die tatsächliche biologische Funktion der RNA G-Quadruplexe im zellulären System noch weitestgehend ungeklärt ist. Um dies aufzuklären, wurde in dieser Arbeit eine Zelllinie generiert, in der die G-Quadruplexsequenz des antiapoptotischen Gens Bcl-2 in der humanen Melanomzelllinie A-375 durch das CRISPR/Cas9 System mutiert wurde. Hierdurch kann kein G-Quadruplex mehr ausgebildet werden. Die Bcl-2 G Quadruplex-defizienten Zellen wiesen im Vergleich zu den Wildtypzellen keine Änderung der endogene Bcl-2 Proteinexpression sowie keine daraus resultierte verstärkte Resistenz gegenüber einem apoptotischen Stimulus auf. Es ist daher denkbar, dass in den bislang publizierten Studien durchgeführte Assays G-Quadruplexe über Reporterplasmide überexprimiert wurden und folglich die Mengen an endogenen Helikasen aufgrund eines hohen Levels von G-Quadruplexen zu Helikasen nicht ausreichten, um diese zu entfalten. Daher deutet die vorliegende Arbeit darauf hin, dass das genomische G-Quadruplex in der 5´-UTR der Bcl-2 mRNA wahrscheinlich durch Interaktionspartner, zum Beispiel die hier identifizierten Helikasen aber auch andere Proteine, entfaltet werden kann. Alle massenspektrometrischen Daten sind über das „ProteomeXchange Consortium“ in der PRIDE Datenbank unter PXD005761 verfügbar.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7132
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6425
Exam Date: 26-Sep-2017
Issue Date: 2017
Date Available: 13-Nov-2017
DDC Class: DDC::500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
Subject(s): G-quadruplex
RNA G-quadruplex binding proteins
translational regulation
cancer
CRISPR Cas9
RNA G-Quadruplex-bindende Proteine
translationale Regulation
Krebs
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Appears in Collections:Institut für Biotechnologie » Publications

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
serikawa_tatsuo.pdf18.12 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons