Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6519
Main Title: Production of extracellular DNA (eDNA) of the γ-Proteobacterium Rheinheimera sp. F8 in biofilms
Translated Title: Produktion extrazellulärer DNA (eDNA) des γ-Proteobakteriums Rheinheimera sp. F8 in Biofilmen
Author(s): Schuster, Anna-Kathrin
Advisor(s): Szewzyk, Ulrich
Referee(s): Szewzyk, Ulrich
Röske, Isolde
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Abstract F8 is a gram-negative γ-Proteobacterium, which belongs to the genus Rheinheimera. The strain has been isolated from the South Saskatchewan River in Canada (Böckelmann, 2002). It has been discovered in previous studies that F8 releases DNA into the extracellular space (Böckelmann et al., 2006; Böckelmann et al., 2007). The aim of this study was a more detailed analysis of the F8 extracellular DNA (eDNA), whereby a main focus was placed on the analysis of F8 biofilms from continuous flow reactors and their visualization with different microscopical methods. For this purpose, two different systems were adapted and employed: a continuous flow reactor and a flow cell, which were operated with oligotrophic freshwater basal medium. Biofilm architecture was visualized by fluorescence microscopy, confocal laser scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Cell numbers in the continuous flow reactor were monitored by flow cytometry and by the drop plate method. eDNA under continuous flow conditions could be detected over the whole time course analyzed (1-21 days) and it was found to be integrated in different ways into the biofilm. It was shown that eDNA develops different morphological structures: it occured as an amorphous mass, but it also formed typical filaments and net-like structures. The results suggested different roles for eDNA in F8-biofilms. Due to its adhesive properties it may facilitate the formation of a characteristic biofilm architecture (e.g. by facilitating microcolony formation). It was observed, that the formation of filaments and nets is especially pronounced under highly nutrient-limited conditions. This indicates that eDNA may confer advantages to the bacteria by improving nutrient access: either by capturing nutrients or by serving as a nutrient source itself. Furthermore, it has been shown by LIVE/DEAD Baclight staining that the vast majority of cells in the biofilms displayed green fluorescent signals and almost all of them were closely associated with small clouds of eDNA. This indicates that F8 cells excrete eDNA (also) by a lysis-independent mechanism. A draft sequence of the F8 genome was determined de novo by shot gun-sequencing and the genome was annotated with the RAST server. These data build an important base for the further elucidation of eDNA-production, -excretion and -utilization in F8 biofilms. In the final assembly of the draft genome, a 4,464,511-bp sequence was generated. 3,970 protein coding sequences, 9 genes for rRNAs (including 3 versions for 16S rRNA) and 83 genes for tRNAs were found. The G+C content is 51.8 %.
F8 ist ein gram-negatives γ-Proteobakterium, welches der Gattung Rheinheimera zugeordnet wird und aus dem South Saskatchewan River in Kanada isoliert wurde (Böckelmann, 2002). Es wurde in vorhergehenden Studien gezeigt, dass der Stamm extrazelluläre DNA (eDNA) bildet (Böckelmann et al., 2006; Böckelmann et al., 2007). In dieser Arbeit wurde die eDNA-Produktion von F8 in verschiedenen Biofilmreaktoren unter kontinuierlichen und stationären Bedingungen in oligotrophem fresh water basal medium (FBM) untersucht. Ein besonderes Augenmerk lag hierbei auf der Visualisierung von F8-Biofilmen, welche unter kontinuierlichen Bedingungen gebildet wurden. Hierfür wurde ein kontinuierlicher Biofilmreaktor modifiziert sowie eine Flow Cell eingesetzt. Zur Untersuchung der Biofilme wurden verschiedene mikroskopische Methoden verwendet (Fluoreszenzmikroskopie, Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (konfokale LSM), Rasterelektronenmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie). Anhand von Flowzytometrie und der Drop Plate Methode wurde die Zellzahlentwicklung im kontinuierlichen Biofilmreaktor quantitativ überwacht. Anhand der mikroskopischen Untersuchungen (insbesondere konfokale LSM in Kombination mit DNA-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen) konnte gezeigt werden, dass F8 in kontinuierlichen Systemen über den gesamten untersuchten Zeitraum (Tag 1 bis 21) eDNA bildet. Besonders in Biofilmen aus dem kontinuierlichen Biofilmreaktor wurden sehr große Mengen eDNA gefunden. Die Visualisierungen ergaben, dass sich eDNA in verschiedenen morphologischen Ausprägungen in F8 Biofilmen manifestiert: eDNA liegt dort als amorphe Masse oder in Form von charakteristischen Filamenten und Netzwerken vor. Aus den Experimenten können verschiedene Rollen abgeleitet werden, welche die eDNA in F8-Biofilmen übernimmt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eDNA durch ihre adhäsiven Eigenschaften zur charakteristischen F8-Biofilm-Architektur beiträgt. Unter Bedingungen besonders starker Nährstoffstofflimitierung wurde besonders starke eDNA-Filament und -Netzwerkbildung beobachtet, was darauf hindeutet, dass der eDNA unter limitierten Bedingungen Vorteile durch Verbesserung der Nährstoffversorgung verschafft. Es ist denkbar, das ihr in Biofilmen eine „Angelroutenfunktion“ zukommt - sie also durch einfangen von Nährstoffen die Versorgung der Bakterien verbessert oder das Makromolekül selbst als Ressource verwendet wird. Des Weiteren wurde anhand von LIVE/DEAD Baclight Fluoreszenzfärbung gezeigt, dass beinahe alle Zellen in den Biofilmen intakte Zellmembranen (Syto9-gefärbt) haben und die überwiegende Mehrheit mit eDNA assoziiert ist (PI-gefärbt). Dies deutet darauf hin, dass der eDNA-Ausschleusung (auch) ein lyse-unabhängiger Prozess zugrunde liegt. Die Primärsequenz des F8-Genoms wurde per Shotgun-Sequenzierung entschlüsselt und eine Draft-Sequenz wurde erstellt. Das Genom hat eine Länge von 4.464.511 bp, wobei die Annotation mit dem RAST-Server das Vorhandensein von 3.970 proteinkodierenden Sequenzen, 9 Genen für rRNAs (3 Versionen für 16S rRNA) und 83 Genen für tRNAs ergab. Der G+C-Gehalt liegt bei 51,8 %.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7243
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6519
Exam Date: 27-Jul-2017
Issue Date: 2017
Date Available: 1-Dec-2017
DDC Class: DDC::500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): eDNA
biofilms
biofilm reactor
CLSM
fluorescence microscopy
extracellular DNA
Rheinheimera
Biofilme
Biofilmreaktor
konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
Fluoreszenzmikroskopie
extrazelluläre DNA
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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