Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6520
Main Title: Entwicklung von HPLC-MS/MS-Methoden zum Nachweis von proteinbasierten Bindungssystemen in Fleisch und Fleischerzeugnissen
Translated Title: Development of HPLC-MS/MS methods for the detection of protein based binding systems in meat and meat products
Author(s): Jira, Wolfgang
Advisor(s): Kroh, Lothar W.
Referee(s): Kroh, Lothar W.
Lautenschläger, Ralf
Schwägele, Fredi
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
de
Abstract: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden auf Basis der Kopplung von Hochleistungsflüssigchromatographie und Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) basierende Methoden zum Nachweis des Einsatzes der marktrelevanten proteinbasierten Bindungssysteme mikrobielle Transglutaminase (TG) und Fibrinogen/Thrombin (FT) von Rind und Schwein bei Fleisch und rohen Fleischerzeugnissen entwickelt. Für die Erarbeitung einer HPLC-MS/MS-Methode zum Nachweis von TG in restrukturiertem Fleisch (Schwein, Rind, Huhn und Pute) wurden Versuche zur proteinbasierten Bindung mit zwei technischen TG-Mischungen mit und ohne Caseinat durchgeführt. Nach der Ermittlung von sechs charakteristischen TG-Markerpeptiden (8 bis 11 Aminosäuren), der Etablierung einer neuen Probenentfettung mittels beschleunigter Lösungsmittelextraktion sowie der Optimierung der Bedingungen für Proteinextraktion und tryptischen Verdau wurden restrukturierte Fleisch- und entsprechende Kontrollproben in rohem und erhitztem Zustand untersucht. Anhand der Detektion von vier ausgewählten TG-Markerpeptiden mit jeweils drei Massenübergängen war ein sicherer Nachweis des Bindungssystems möglich und es wurden keine falsch positiven bzw. falsch negativen Ergebnisse erhalten. Untersuchungen von unterschiedlich vorbehandelten Fleischproben (Ölmarinade, Emulsionsmarinade, Gewürzsalz und Panade) zeigten, dass die Fleischvorbehandlung nur geringe Auswirkungen auf die Nachweisbarkeit von TG hat. Die Nachweisgrenzen der entwickelten Methode lagen sowohl für rohes als auch für erhitztes Fleisch etwa um den Faktor 10 unter den empfohlenen TG-Zugabemengen und damit in einem Konzentrationsbereich, in dem keine Bindungseffizienz mehr erzielt werden konnte. Durch die zusätzliche Bestimmung von Casein-Markerpeptiden konnte zudem ein simultaner Nachweis von potenziell allergenen Milchproteinen realisiert werden. Anhand der Untersuchung von restrukturierten Rohschinken, die mit verschiedenen TG-Konzentrationen hergestellt worden waren, wurde überprüft, ob die proteolytische Aktivität während der Rohschinkenreifung zu einem Abbau von TG und damit zu einer Abnahme der Nachweisbarkeit der TG-Markerpeptide führt. Dabei konnte gezeigt werden, dass es während der 43-tägigen Lagerung zu keiner signifikanten Abnahme der Nachweisbarkeit von TG kam. Durch den Einsatz von mittels mikrowellenaktivierter Festphasensynthese hergestellten isotopenmarkierten Peptiden als internen Standardverbindungen konnten die Gehalte an zwei ausgewählten TG-Markerpeptiden ermittelt werden. Diese zeichneten sich durch gute Wiederfindungsraten aus und wiesen hohe Korrelationen zu der eingesetzten TG-Konzentration auf. Die Nachweisgrenzen der TG-Markerpeptide lagen etwa um den Faktor 20 unter der empfohlenen TG-Zugabemenge. Die für die TG-Analytik etablierte HPLC-MS/MS-Methode wurde auf Basis der hierbei verwendeten Proteinextraktions- und Verdaubedingungen zu einem simultanen Nachweisverfahren von TG und FT weiterentwickelt, indem jeweils sechs charakteristische Markerpeptide für Fibrinogen von Rind und Schwein (8 bis 16 Aminosäuren) in die bestehende Analysenmethode integriert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Differenzierung von FT von Rind und Schwein sowie ein simultaner Nachweis von TG und FT möglich ist. Bei Einsatz der für die Restrukturierung von Rind- und Schweinefleisch empfohlenen Mengen an FT der gleichen Tierart wiesen die Fibrinogen-Markerpeptide in restrukturiertem Fleisch im Vergleich zu den aus dem Restblut der Fleisch-Kontrollproben stammenden Fibrinogen-Markerpeptiden etwa um den Faktor 100 erhöhte Peakflächen auf. Diese signifikanten Erhöhungen konnten anhand der mit Hilfe des Einsatzes von isotopenmarkierten internen Standardverbindungen ermittelten Gehalte von ausgewählten Fibrinogen-Markerpeptiden bestätigt werden. Eine Differenzierung der Verwendung von FT und Blutplasmapulver könnte anhand der Peakflächenverhältnisse von Fibrinogen- zu Serotransferrin-Markerpeptiden vorgenommen werden.
In this work, analytical methods based on a coupling of high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) for the detection of the market relevant protein-based binding systems microbial transglutaminase (TG) and fibrinogen/thrombin (FT) from beef and pork in meat and raw meat products have been developed. For the development of an HPLC-MS/MS method for the detection of TG in restructured meat (pork, beef, chicken and turkey), meat binding experiments with two technical TG mixtures with and without caseinate were performed. After the determination of six characteristic TG marker peptides (8 – 11 amino acids), establishing a methodology for defatting of samples using pressurized liquid extraction and optimizing the conditions of protein extraction and tryptic digestion, samples of restructured meat and corresponding blank values were analyzed in a raw and heated state. Using four selected TG marker peptides with three mass transitions each, no false-positive or –negative results were obtained. By investigation of samples pre-treated with oil marinade, emulsion marinade, seasoning salt and breadcrumbs, only very little effects of the type of pre-treatment on the detectability of TG were found. The limits of detection of the developed method were about a factor of 10 below the recommended amount of TG for raw as well as heated restructured meat and thus in a scale, in which no binding efficiency was achieved any more. By the additional measurement of casein marker peptides, the simultaneous detection of these important milk allergens was possible. On the basis of investigations of restructured hams, which had been produced with different TG concentrations it was verified, whether the proteolytic activity during the ripening process leads to an enzymatic degradation of TG and consequently to a decrease of the detectability of the TG marker peptides. It was shown that a decrease of TG detectability during the storage time for 43 days of dry-cured formed ham was not observed. The contents of two selected TG marker peptides were calculated using isotope-labeled peptides as internal standards, obtained by microwave-assisted solid-phase synthesis. These were characterized by good recoveries and high correlations to the applied TG concentration. The limits of detection of the TG marker peptides were about a factor of 20 below the recommended addition of TG. Based on the HPLC-MS/MS method established for TG analysis and the conditions of protein extraction and tryptic digestion used therein, an analytical method for the simultaneous detection of TG and FT was developed by the integration of six characteristic marker peptides for beef and pork each (8 – 16 amino acids). It was shown that the simultaneous detection of TG and FT is possible. Using the recommended amounts of FT for restructuring of meat of the same animal species, significantly increased peak areas of the fibrinogen marker peptides (about a factor of 100) in restructured meat compared to the control samples due to residual blood were observed. These substantial increases were confirmed by calculating the contents of selected fibrinogen marker peptides using isotope-labelled internal standards. A differentiation between the use of blood plasma powder and FT using the ratios of fibrinogen to serotransferrin peptide peak areas seems to be possible.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7244
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6520
Exam Date: 17-Nov-2017
Issue Date: 2017
Date Available: 1-Dec-2017
DDC Class: DDC::500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::543 Analytische Chemie
Subject(s): Fleisch
mikrobielle Transglutaminase
Fibrinogen
Thrombin
HPLC-MS/MS
meat
microbial transglutaminase
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