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Main Title: Proteome characterization of Escherichia coli cells evolved to tolerate elongation factor P deletion
Translated Title: Proteom-Charakterisierung von Escherichia coli-Zellen entwickelt um die Deletion von Elongationsfaktor P zu tolerieren
Author(s): Wang, Mingjian
Advisor(s): Budisa, Nediljko
Dumit, Verónica
Referee(s): Budisa, Nediljko
Wilson, Daniel
Dumit, Verónica
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Elongation factor P (EF-P) is an essential translation factor in bacteria, it has been reported that EF-P plays an important role in rescuing the translation stalling caused by the oligo-proline containing peptides stretch. The growth rate of E. coli was significantly restricted when EF-P was knocked out. However, through a continuous directed evolution in the turbidostatic model, both the wildtype and the EF-P knock-out strains grow robustly. To elucidate possible mechanism behind the robust growth established during the adaptation in under the conditions of continuous cultivation, we employed a high-throughput proteome approach, which involves mass spectrometry (MS) and stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). In addition, YeiP has been considered as a paralog of EF-P. In order to reveal whether YeiP’s function overlaps those of EF-P, the proteomics study was also performed on YeiP knock-out strains and on an EF-P and YeiP double knock-out strain. In order to employ SILAC-based MS, argA and lysA genes had to be knock-out from all strains studied. Continuous directed evolution proved to have a negative effect on the level of a large amount of proteins involved in ATP-dependent biosynthetic pathways, chemotaxis and flagellar assembly. In the comparison of the EF-P knock-out strain and the control strain, the most interesting change is the down-regulation of the iron metabolism related proteins, which are involved in enterobactin biosynthesis and the sulfur mobilization (SUF) system for Fe-S cluster assembly. After the evolution, the level of the proteins participating in the enterobactin biosynthesis pathway was not significantly changed, but the proteins from the SUF system were significantly up-regulated. Additionally, MS data on oligo-proline containing proteins revealed that the absence of EF-P did not globally decrease the level of the PP-containing proteins, even up-regulated some of them. Approximately one-third of the quantified PPP-containing proteins were significantly down-regulated by the absence of EF-P. After the evolution process, a partial recovery of these proteins’ values was observed. The YeiP knock-out strain did not show the same behavior regarding its growth rate and proteome changes as the EF-P knock-out strain when compared to the control. The only significant change that was detected was the up-regulation of MgtA (magnesium-transporting ATPase). The double EF-P and YeiP knock-out strain displayed a lower growth rate but similar proteome changes as the EF-P knock-out strain. It indicates that YeiP does not strictly overlap its function to the one of EF-P.
Der Elongationsfaktor P (EF-P) ist ein essentieller Translationsfaktor in Bakterien. Es wurde berichtet, dass EF-P eine wichtige Rolle beim Verhindern von ribosomalem stalling spielt, die durch Oligoprolinabschnitte in Peptiden verursacht werden. Die Wachstumsrate von E. coli war signifikant verringert wenn EF-P knockout war. Jedoch wuchsen durch kontinuierliche gerichtete Evolution des turbidostatischen Models sowohl der Wildtyp als auch der EF-P-Knockout-Stamm robust. Um die Mechanismen dieses robusten Wachstums aufzudecken, wurde ein high-throughput Proteomansatz etabliert, der Massenspektrometrie (MS) und „stable isotope labeling by amino acids in cell culture“ (SILAC) enthält. Zusätzlich wurde YeiP als Paralog von EF-P betrachtet. Um herauszufinden, ob die Funktion von YeiP die von EF-P überschneidet wurden die proteomischen Untersuchungen auch an YeiP-Knockout-Stämmen und an YeiP- und EF-P-Doppelknockout-Stämmen durchgeführt. Um die SILAC-basierte MS einzuführen, mussten argA und lysA Gene von allen untersuchten Stämmen knockout werden. Es ist bewiesen, dass die kontinuierliche gerichtete Evolution einen negativen Effekt auf den Gehalt von vielen Proteinen hat, die in den ATP-abhängigen Biosytheseweg und Chemotaxis involviert sind. Im Vergleich zwischen EF-P-Knockout und dem Kontrollstamm ist die interessanteste Veränderung die Runterregulierung von Proteinen, die mit dem Eisenmetabolismus zusammenhängen. Diese Proteine sind an der Enterobaktinbiosynthese und dem Schwefelmobilisierungssystem (SUF) für Fe-S Cluster beteiligt. Nach der Evolution war der Gehalt an Proteinen die in der Enterobaktinbiosynthese beteiligt sind nicht signifikant verändert, allerdings waren die Proteine des SUF-Systems signifikant hoch reguliert. Außerdem wurde über die MS Daten von Oligoprolinhaltigen Proteinen erkannt, dass die Abwesenheit von EF-P den Gehalt von PP-haltigen Proteinen nicht global verringert, sondern einige sogar hoch reguliert. Ungefähr ein Drittel der quantifizierten PPP-haltigen Proteine waren durch die Abwesenheit von EF-P signifikant runter reguliert. Nach dem Evolutionsprozess wurde eine partielle Wiederherstellung dieser Proteingehalte festgestellt. Der YeiP-Knockout-Stamm zeigte nicht das gleiche Verhalten in Bezug auf Wachstumsrate und Veränderung des Proteoms wie der EF-P-Knockout-Stamm im Vergleich zur Kontrolle. Die einzige signifikante Veränderung die festgestellt werden konnte war die Hochregulierung von MgtA (Magnesium-transportierende ATPase). Der EF-P-YeiP-Doppelknockout-Stamm zeigte eine geringere Wachstumsrate, aber ähnliche Veränderungen des Proteoms wie der EF-P-Knockout-Stamm. Dies deutet an, dass die Funktion von YeiP nicht zwingend die Funktion von EF-P überschneidet.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7255
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6531
Exam Date: 26-Oct-2017
Issue Date: 2017
Date Available: 8-Dec-2017
DDC Class: 572 Biochemie
Subject(s): elongation factor P
proteomics
E. coli
SILAC
adaptation
Elongationsfaktor P
Proteomik
Escherichia coli
Anpassung
License: https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/
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