Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6555
Main Title: Impacts of oscillating cultivation conditions on the quality of recombinant inclusion bodies in Escherichia coli
Translated Title: Einfluss von oszillierenden Kultivierungsbedingungen auf die Qualität rekombinanter Inclusion-Bodies in Escherichia coli
Author(s): Reitz, Christian
Advisor(s): Neubauer, Peter
Referee(s): Neubauer, Peter
Meyer, Vera
Takors, Ralf
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: The controlled use of microorganisms in the pharmaceutical, (bio-)chemical and life science industries to produce recombinant proteins or other organic compounds in large-scale bioreactors is a standard procedure today. However, predicting the process performance after scaling up from the development scale to the final production scale is still a critical problem in modern bioprocess development. With increasing cultivation scale inhomogeneities start to appear. Due to insufficient mixing caused by limited power input and the use of highly concentrated and viscous feeding solutions, substrate excess in a zone near the feeding point can be detected, triggering higher metabolic activity and thus oxygen limitation. The limited mixing also leads to starvation conditions in other compartments of the bioreactor, where almost no substrate can be detected. Close to the aeration inlet, this may lead to cells experiencing starvation combined with oxidative stress. To study the effects of these oscillating cultivation conditions on a miniproinsulin producing Escherichia coli K-12 strain two- and three-compartment scale-down bioreactors were used in this thesis. The second compartment represents a “feeding zone” with high substrate availability and oxygen limitation and the third compartment additionally incorporates oscillating starvation conditions. The third compartment could be aerated to combine substrate starvation either with oxygen limitation or oxidative stress, respectively. The results showed increased production of metabolites from the mixed acid fermentation and overflow metabolism pathways. Furthermore, we detected accumulation of the non-canonical amino acids norvaline, norleucine and β-methyl-norleucine and the misincorporation of these amino acids into the recombinant miniproinsulin under oscillating conditions. These results implicate that oscillating cultivation conditions should be already applied at the screening stage at the beginning of bioprocess development to identify production clones with highest productivity and robustness, i.e. product quality under process-like conditions. However, as it is not feasible to use a multi-reactor-scale-down setup for screening many candidate strains due to the complexity of setup and experiments, a further scale-down was performed by using cyclic pulsed-feeding and/or repeated short-time shaker stops in shake flask and multi-well plate one-compartment set-ups. Also, a fluorescence-based assay for at-line characterization and quantification of recombinant miniproinsulin based inclusion bodies on culture- and single-cell-level was developed, which opens at-line monitoring of protein formation as a basis for a novel process analytical tool and process parameter for bioprocess control.
Der Einsatz von (rekombinanten) Mikroorganismen in der pharmazeutischen sowie (bio-) chemischen Industrie und in den Lebenswissenschaften zur Produktion von rekombinanten Proteinen und kleineren organischen Molekülen ist weit verbreitet. Die moderne Bioprozessentwicklung hat jedoch bis heute das Problem, das Potential eines neuen Prozesses nach dem Transfer vom Forschungsmaßstab in den finalen Prozessmaßstab vorherzusagen. Der Grund hierfür sind Inhomogenitäten und Gradienten, die bei größer werdendem Kultivierungsmaßstab auftreten, denn der ab einem bestimmten Volumen limitierende Leistungseintrag führt zu mangelhafter Mischung des Bioreaktors. Die Zufütterung von hochkonzentrierten und oft viskosen Lösungen im Fed-batch-Verfahren führt zu einem Bereich im Reaktor mit erhöhter Substratkonzentration nahe des Zulaufs der Substratlösung, die eine hohe metabolische Aktivität und Sauerstofflimitation in dieser Ebene verursacht. Im Gegensatz führt das eingeschränkte Mischen in anderen Regionen des Reaktors zu Substratmangel und Hunger. Sollte der Lufteinlass nicht nahe der Substratzuführung erfolgen, kommt es dort neben Hunger- auch zu oxidativem Stress. Um die Effekte von oszillierenden Kultivierungsbedingungen auf insulin-produzierende rekombinante Escherichia coli K-12 zu untersuchen, wurden ein Zwei-Kompartiment-Reaktor (2CR), in dem ein zweiter Reaktor eine „Fütterungs-Zone“ mit Substrat-Überschuss und Sauerstoff-Limitation darstellt, und ein Drei-Kompartiment-Reaktor, bei dem ein weiterer, dritter Reaktor zusätzlich oszillierende Hungerbedingungen simuliert. Das dritte Kompartiment wurde zusätzlich begast, sodass simulierte Hunger-Bedingungen entweder mit Sauerstoff-Limitation oder oxidativen Stress verbunden werden konnten. Die Ergebnisse zeigten eine erhöhte Produktion von Komponenten des Überflussmetabolismus und der gemischten Säure-Gärung unter oszillierenden Bedingugen. Darüber hinaus konnte eine Akkumulation von nicht-kanonischen Aminosäuren wie Norvalin, Norleucin und β-Methyl-Norleucin und der Fehleinbau dieser Aminosäuren in das rekombinante Miniproinsulin nachgewiesen werden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass inhomogene Kultivierungsbedingungen bereits frühzeitig in der Bioprozessentwicklung bedacht und angewendet werden sollten, um bereits beim Screening Klone zu identifizieren, die unter Prozess-simulierenden Bedingungen und nicht unter optimalen Laborbedingungen höchste Produktivität und Robustheit zeigen. Ein Multi-Reaktor-System ist bedingt durch seine Komplexität für ein Screening einer möglichst hohen Zahl potentieller Kandidaten jedoch ungeeignet. Der Vergleich von Kultivierungen in einem Zwei-Kompartiment-Reaktor mit einem Ein-Kompartiment-Reaktor-Ansatz mit gepulster Substrat-Zugabe eröffnete die Möglichkeit oszillierende Kultivierungsbedingungen in einem Hochdurchsatz tauglichen Setup einzusetzen. Auch wurde der Einfluss oszillierender Sauerstoffverfügbarkeit auf die Produktqualität in Multi-Well-Platten als kleinsten verfügbaren Maßstab untersucht. Abschließend wurde ein fluoreszenz-basierter Test zur schnellen Charakterisierung und Quantifizierung der Produktion von Inclusion bodies bestehend aus dem rekombinanten Miniproinsulin im Kultur- und Einzel-Zell-Maßstab etabliert. Dieser Assay ermöglicht die at-line Erfassung der Bildung rekombinanter Proteine in Inclusion bodies und hat somit das Potential als neues PAT (Process Analytical Tool) und Prozess-Kontroll-Parameter zu dienen.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7282
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6555
Exam Date: 21-Apr-2017
Issue Date: 2017
Date Available: 15-Dec-2017
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): scale-down
large-scale
fed-batch cultivation
non-canonical amino acids
recombinant proteins
Maßstabsverkleinerung
Industriemaßstab
Fed-Batch Kultivierung
nicht-kanonische Aminosäuren
rekombinante Proteine
License: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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