Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6587
Main Title: Uptake, physiological responses and technical application of the aquatic fungus Mucor hiemalis EH5 for the removal of cyanobacterial toxins
Translated Title: Aufnahme, physiologische Antworten und technische Nutzung vom aquatischen Pilz Muor hiemalis EH5 zur Beseitigung cyanobakterieller Toxine
Author(s): Balsano, Evelyn
Advisor(s): Pflugmacher Lima, Stephan
Referee(s): Pflugmacher Lima, Stephan
Hoque, Enamul
Meyer, Vera
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Many cyanobacteria produce various harmful secondary metabolites, a.k.a. cyanotoxins, which cause global concerns because of their hazardousness to ecosystems and human health. Due to their diversity in origin and structure, cyanotoxins express different biological activities commonly including the generation of oxidative stress. This work focuses on the three most frequently occurring cyanotoxins, the hepatotoxin microcystin LR (MC LR), the cytotoxin cylindrospermopsin (CYN) and the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine (BMAA) at environmentally relevant concentrations as a representative study, with special emphasis on MC LR. The removal of cyanotoxins is essential to ensure water quality and safety and therefore mycoremediation of these toxins using Mucor hiemalis EH5 in pellet morphology was considered. M. hiemalis has been shown to resist environmental perturbations and still sporulates at groundwater temperatures of 5 °C. Most importantly, it expresses high glutathione S-transferase activity, which was shown to be involved in the enzymatic degradation of the herbicide isoproturon in combination with the lignolytic model white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. The aim of the present study was therefore to investigate cyanotoxin uptake, physiological responses, and the degradation ability of M. hiemalis with regards to assess its applicability for future technical applications for the removal of cyanotoxins from surface waters. First (Paper I), mycelial M. hiemalis grown on agar petri dishes in the presence of cyanotoxins was investigated in terms of sensitivity using an adaptation of the Kirby-Bauer disk diffusion assay, and fungal growth and biomass production via radial extension and dry weight measurements, respectively. Although cyanotoxins are considered antimicrobial, M. hiemalis exhibited unchanged radial expansion and biomass production. Quantification of internalized cyanotoxin concentration was achieved via liquid chromatography tandem mass spectrometry of the fungal extracts to show the biosorption capability of M. hiemalis. The second part (Paper II) investigated the influence of different factors, media type, temperature, agitation rate, inoculum size, pH, additives, flask shape, and volume on pellet formation probability of M. hiemalis in submerged cultivation. Considering the advantages of using fungal pellets in bioreactors, an optimized method for the pellet production of the aquatic fungus was established. Fungal pellets were, in a third part (Paper III), exposed to MC LR, CYN, and BMAA to investigate antioxidative and biotransformation enzyme responses, including the biomarkers, catalase, glutathione reductase, glutathione peroxidase, and glutathione S-transferase. It was thereby confirmed that M. hiemalis does not or only slightly suffer from oxidative stress in the presence of MC LR and BMAA as well as that it can handle CYN-induced oxidative stress. These findings are important when considering a fungus for mycoremediation application as it indicates the fungus’s ability to cope with exposure to the cyanotoxins in question. The degradation ability of M. hiemalis was estimated, using MC LR as an example, by monitoring the reduction in cyanotoxin concentration from medium over time (Chapter 5). Removal efficiency was compared in nutrient-rich and limiting medium and versus the degradation ability of P. chrysosporium in single as well as in co-culture. Results indicate an involvement of internal/external MC-LR degradation processes by M. hiemalis, however, at the same time, the need of further optimization in order to consider mycoremediation applications. In conclusion, this work demonstrated the resistance and overall growth fitness of M. hiemalis towards a broad range of exposure concentrations of the three structurally diverse cyanotoxins MC LR, CYN, and BMAA and thus proves its survival, viability, and longevity in their presence. M. hiemalis was easily stimulated and maintained in growing as pellets, which facilitates the handling and cultivation. Oxidative stress tolerance of the fungal pellets towards the three cyanotoxins was demonstrated, which indicates its ability to cope with the exposure on a physiological level. Cyanotoxin removal capacity of M. hiemalis was demonstrated, however, efficiency needs to be further optimized. Future studies should therefore include the influence of different factors, such as co-cultivation, pH optimum establishment, temperature variations, medium composition, etc. in order to enhance fungal degradation efficiency. The results from the present study do, however, present M. hiemalis as an attractive candidate for future applications in the removal of cyanotoxins.
Viele Cyanobakterienarten produzieren verschiedene giftige Sekundärmetabolite, so genannte Cyanotoxine, die weltweit eine Bedrohung für das Ökosystem und die menschliche Gesundheit darstellen. Aufgrund ihrer diversen Herkunft und Struktur, unterscheiden sich Cyanotoxine in ihrer Wirkungsweise, oftmals mit der gemeinsamen Eigenschaft, oxidativen Stress zu generieren. Diese Arbeit befasst sich mit drei meist vorkommenden Cyanotoxinen, dem Hepatotoxin microcystin LR (MC LR), dem Cytotoxin cylindrospermopsin (CYN) und dem Neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine (BMAA) repräsentativ bei umweltrelevanten Konzentrationen, mit speziellem Fokus auf MC LR. Die Entfernung von Cyanotoxinen ist essentiell, um die Wasserqualität und -sicherheit zu gewährleisten und zu diesem Zweck wurde die Mykoremediation mittels Mucor hiemalis EH5 in Pelletmorphologie in Betracht gezogen. M. hiemalis hat sich als beständig gegen störende Umwelteinflüsse erwiesen, sporuliert auch noch bei Grundwassertemperaturen von 5 °C und besitzt vor allem eine hohe Glutathion S-Transferaseaktivität. Letzteres spielte eine entscheidende Rolle beim Abbau des Herbizids Isoproturon in Verbindung mit Phanerochaete chrysosporium, dem bekanntesten Vertreter der lignolytischen Weißfäulepilze. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb darin, die Cyanotoxinaufnahme, physiologischen Antworten und das Degradationspotential von M. hiemalis zu untersuchen mit Berücksichtigung auf seine Anwendbarkeit zur technischen Umsetzung für die Cyanotoxinentfernung aus Oberflächengewässern. Als erstes wurde das Myzel von M. hiemalis auf Agarplatten auf seine Empfindlichkeit mittels einer Adaptation des Kirby-Bauer Diffusionsassays, als auch sein Wachstum und die Biomasseproduktion mittels radialer Wachstumsrate und Trockengewichtmessungen bestimmt. Trotz der antimikrobiellen Wirkung von Cyanotoxinen wurde kein Einfluss auf die radiale Ausbreitung und Biomasseproduktion von M. hiemalis beobachtet. Mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie der Pilzextrakte wurde die aufgenommene Cyanotoxinmenge quantifiziert und die Fähigkeit von M. hiemalis zur Biosorption gezeigt. Der zweite Teil erforschte den Einfluss verschiedener Faktoren (Art des Nährmediums, Temperatur, Schüttelfrequenz, Konzentration des Inokulums, pH-Wert, Zusätze, Kolbenform und Volumen) auf die Wahrscheinlichkeit der Pelletbildung von M. hiemalis in der Flüssigkultur. Da Pilzpellets in Bioreaktoren viele Vorteile mit sich bringen, wurde eine optimale Methode zur Pelletbildung des aquatischen Pilzes etabliert. Im dritten Teil wurden die gebildeten Pilzpellets mit MC LR, CYN und BMAA exponiert, um die enzymatischen Antworten des antioxidativen Systems und der Biotransformation zu untersuchen, was die Biomarker Katalase, Glutathionreduktase, Glutathionperoxidase und Glutathion S-Transferase miteinschließt. Dabei wurde ersichtlich, dass M. hiemalis keinen, bzw. nur geringen oxidativen Stress in Gegenwart von MC LR und BMAA erleidet, sowie CYN generierten oxidativen Stress tolerieren kann. Diese Erkenntnisse sind wichtig, um einen Pilz zur Mykoremediation umzusetzen, da sie seine Fähigkeit zeigen, die Exposition mit Cyanotoxinen auszuhalten. Die Degradationsfähigkeit von M. hiemalis wurde am Beispiel von MC LR ermittelt, wobei die Abnahme der Cyanotoxinkonzentration im Medium über die Zeit gemessen wurde. Die Eliminierungsleistung von M. hiemalis wurde in nährstoffreichem und nährstoffarmem Medium verglichen und dem Degradationspotential von P. chrysosporium in alleiniger, bzw. Co-Kultur gegenübergestellt. Die Ergebnisse deuten auf interne/externe MC LR Degradationsprozesse durch M. hiemalis hin, machen aber gleichzeitig deutlich, dass es weiterer Optimierung bedarf, um tatsächlich eine Mykoremediation als Anwendung in Erwägung ziehen zu können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die Resistenz und allgemeine Wachstumsfitness von M. hiemalis gegen drei strukturell unterschiedliche Cyanotoxine MC LR, CYN und BMAA in einem breiten Konzentrationsbereich und beweist deshalb sein Überleben, Überlebensfähigkeit und Langlebigkeit in deren Gegenwart. Pellets von M. hiemalis konnten leicht induziert und auch beibehalten werden, was das Handling und die Kultivierung erleichtert. Es konnte eine oxidative Stresstoleranz der Pilzpellets gegenüber der drei Cyanotoxinen bewiesen werden, was die Fähigkeit zur Expositionsbewältigung auf der physiologischen Ebene beweist. Auch wenn die Cyanotoxinentfernung durch M. hiemalis verdeutlicht werden konnte, muss die Effizienz weiterhin verbessert werden. Zukünftige Studien sollten deshalb den Einfluss verschiedener Faktoren, wie z.B. Co-Kultivierung, optimale pH-Wert Bestimmung, Temperaturänderungen, Mediumzusammensetzung, usw. umfassen, um die Abbauleistung der Pilze zu steigern. Nichtsdestotrotz präsentieren die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit M. hiemalis als attraktiven Kandidaten für künftige technische Anwendungen zur Entfernung von Cyanotoxinen.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7314
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6587
Exam Date: 5-Oct-2017
Issue Date: 2017
Date Available: 30-Dec-2017
DDC Class: 571 Physiologie und verwandte Themen
Subject(s): biotransformation
cyanotoxin
degradation
microcystin-LR
mycoremediation
Mykoremediation
License: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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