Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6614
Main Title: Application of the enzyme controlled glucose feeding for the production of recombinant proteins
Subtitle: starter cultures and autoinduction
Translated Title: Anwendung der enzymkontrollierten Glukosefütterung zur Herstellung von rekombinanten Proteinen
Translated Subtitle: Starterkulturen und Autoinduktion
Author(s): Abdou Ali, Basant
Advisor(s): Neubauer, Peter
Referee(s): Neubauer, Peter
Garbe, Leif-Alexander
Vasala, Antti
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: One of the prime objectives of any bioprocess development is to enhance the microbial growth and product yields. Correspondingly, for recombinant proteins it is the aim increase the yields of the soluble, active and correctly folded molecule. There are many factors that could influence the product yield like medium optimization and the performance of the bioprocess itself. The aim of this study is; (i) to investigate the enzymatic glucose feeding system as a pre-cultivation system for recombinant E. coli, (ii) To proof the scalability of this system as a main cultivation system for the production of a recombinant nucleoside phosphorylase, (iii) The application of autoinduction jointly with the enzyme based fed-batch technique with different induction protocols and (iv) to investigate the cell physiology upon exposure to a multi-substrate system during the diauxic growth. Regarding the first point, robust pre-cultures of recombinant E. coli strains were obtained by fed-batch cultivations using the enzymatic glucose feeding system. According to the time plan of the expression experiment or bioreactor cultivation, potent short term (6-8 hours) or overnight pre-cultures were performed. Preparation of the pre-culture as a fed-batch process provides a well-controlled starter culture in a growing state instead of commonly applied overnight stationary phase cultures. A scalability study for the enzymatic glucose feeding system (Enpresso B growth system) was performed with the optimized conditions using a nucleoside phosphorylase (NP) as a model protein. The results showed a more than three-fold increase in the protein activity and a 30% increase of the cell density from the well plate scale to the shake flask level. While about 25% increase was obtained by application of this system in the benchtop-bioreactor scale. The effect of the IPTG on the expression of recombinant nucleoside phosphorylases was observed in autoinduced and single shot induced cultures. IPTG-autoinduced Enpresso cultures reached nearly the same nucleoside phosphorylase activity (≈ 3.0 - 3.5 U mL-1) as obtained by single shot induced cultures in 15 hours shorter cultivations. However, the cell density in cultures with autoinduction was less than half of that of single shot induced cultures. Optimal concentrations for autoinduction were 70-100 μM IPTG or 2.0 g L-1 lactose, respectively. Autoinduction is based on the de-repression of the lac promoter in glucose deficient conditions under diauxic regulation. A clear diauxic lag phase after the end of the batch phase (time of glucose consumption) was observed in E. coli diauxic growth. The length of this lag phase was around 30 minutes. By applying the diauxie cultivation at the benchtop-bioreactor scale, more than one lag phase was observed upon consumption of different substrates. Eventually, three phases seem to be relevant, related to the consumption of different substrates: (i) batch on glucose, (ii) consumption of lactose and metabolism of the glucose part, and finally (iii) consumption of the galactose part. Additionally, acetate as the metabolic byproduct was consumed as a fourth substrate (i) in the diauxic lag phase and (ii) at the end of the cultivation.
Die Erhöhung des mikrobiellen Wachstums und des Produktionsertrages gehören zu den wichtigsten Zielen jeder Bioprozessentwicklung. Entsprechend ist es für rekombinante Proteine das Ziel, die Ausbeuten des löslichen, aktiven und korrekt gefalteten Moleküls zu erhöhen. Es gibt viele Faktoren, die den Produktionsertrag beeinflussen können, wie die Optimierung von Medien und die Leistung des Bioprozesses. Die Ziele dieser Studie sind folgendermaßen zusammenzufassen: (i) Erforschung des enzymatischen Glukose-Zufütterungssystems als ein Vorkultivierungs-System für rekombinaten E. coli, (ii) Nachweis der Skalierbarkeit dieses Systems als Hauptkultivierungs-System für die Herstellung einer rekombinanten Nukleosidphosphorylase, (iii) Die Anwendung der Autoinduktion gemeinsam mit der Enzym-basierten Fed-Batch Technik mit verschiedenen Induktionsprotokollen und (iv) Erforschung der Zellphysiologie nach Exposition gegenüber einem Multi-Substrat-System während des diauxischen Wachstums. Das erste Ziel betreffend, wurden robuste Vorkulturen eines rekombinanten E. coli Stammes in Fed-Batch Kultivierungen unter Verwendung des Glukose-Freisetzungssystems generiert. Je nach Zeitpunkt des Expressionsexperiments oder Bioreaktor-kultivierung, potente Kurzzeit- (6-8 Stunden) oder Über Nacht-Vorkulturen durchgeführt wurden. Die Vorbereitung der Vorkultur als Fed-Batch-Prozess bietet eine gut kontrollierte Starterkultur in einem wachsenden Zustand anstelle von üblicherweise angewandten über Nacht stationären Phasenkulturen. Eine Skalierbarkeitsstudie für das enzymatischen Glukose-Zufütterungssystems (Enpresso B Wachstums-System) wurde unter optimierten Bedingungen Verwendung der Nukleosidphosphorylase (NP) als Modellprotein durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine mehr als dreifache Anstieg der Proteinaktivität beziehungsweise eine 30% Zelldichte vom Well-Platten-Maßstab bis zum Schüttelkolben-Maßstab. Während die Anwendung dieses Systems in dem Auftisch-Bioreaktor-Maßstab einen Anstieg von etwa 25% erreichte. Die Wirkung des IPTG auf die Expression rekombinanter Nukleosidphosphorylasen in Autoinduktions- und Single-Shot-induzierten Kulturen beobachtet wurde. IPTG-autoinduzierte Enpresso Kulturen fast dieselbe Nukleosidphosphorylase-Aktivität (etwa 3,0 - 3,5 U mL-1) erreichten, wie die durch Single-Shot-induzierten Kulturen, die eine 15 Stunden kürzere Kultivierungszeit aufwiesen. Jedoch war die Zelldichte, die durch Autoinduktion erreicht wurde, weniger als die Hälfte von Single-Shot-induzierten Kulturen. Optimale Konzentrationen für die Autoinduktion waren jeweils 70-100 μM IPTG bzw. 2,0 g L-1 Lactose. Die Autoinduktion basiert auf der De-Repression des lac-Promotors in glukose-defizienten Zustände unter diauxischer Regulation. Eine deutliche diauxischer Lag-Phase nach dem Ende der Batch-Phase (Zeit des Glukoseverbrauchs) wurde bei einem diauxische Wachstum von E. coli beobachtet. Diese Zeitdauer dieser Lag-Phase betrug etwa 30 Minuten. Durch Anwendung der Diauxie-Kultivierung in dem Bioreaktor-Maßstab wurde mehr als eine Lag-Phase beim Verbrauch unterschiedlicher Substrate beobachtet. Schließlich waren drei Phasen scheinen relevant zu sein, bezogen auf den Verbrauch verschiedener Substrate: (i) Batch-Phase auf Glukose, (ii) Verbrauch von Laktose und Metabolismus des Glukose-Teils und schließlich (iii) Verbrauch des Galactose-Teils. Zusätzlich wurde Acetat, ein metabolisches Nebenprodukt, als viertes Substrat (i) in der diauxischen Lag-Phase und (ii) am Ende der Kultivierung verbraucht.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7350
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6614
Exam Date: 18-Dec-2017
Issue Date: 2018
Date Available: 22-Jan-2018
DDC Class: 579 Mikroorganismen, Pilze, Algen
Subject(s): Escherichia coli
recombinant protein
fed-batch cultivation
pre-culture
EnBase
autoinduction
Diauxic growth
rekombinantes Protein
Fed-Batch-Kultivierung
Vorkultur
Diauxisches Wachstum
License: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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