Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6699
Main Title: Optimizing human Treg stability and target specificity for therapeutic applications
Translated Title: Optimierung der Stabilität und Spezifität von humanen Tregs für therapeutische Anwendungen
Author(s): Nowak, Anna
Advisor(s): Scheffold, Alexander
Referee(s): Lauster, Roland
Kurreck, Jens
Scheffold, Alexander
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Regulatory T cells (Tregs) are essential mediators of tolerance and crucial for the containment of inflammatory immune reactions. Their immunosuppressive potential is currently investigated for the treatment of inflammatory diseases. However, conversion between the Treg and conventional T cell (Tcon) compartment has been described, comprising the induction or loss of the regulatory phenotype in vivo which generates significant safety concerns for the therapeutic use of Tregs e.g. for adoptive transfer. To what extent such Treg plasticity affects the formation and stability of the human Treg compartment and how it influences specific immune responses in vivo is currently unknown. In addition, therapeutic Treg application often requires prolonged in vitro culture to generate sufficient Treg numbers or to optimize their functionality, e.g. via genetic engineering of their antigen receptors. However, purity of clinical Treg expansion cultures is highly variable and it is currently challenging to identify and separate stable Tregs from contaminating Tcons, either ex vivo or after prior expansion. Inaccuracy of the identification of stable Tregs also limits the development of protocols for specific manipulation of Treg functions. Therefore, this study aimed to identify markers for the unambiguous identification of stable Tregs to improve efficacy and safety of in vitro generated Tregs as well as to provide insight into the heterogeneity and stability of the physiological Treg compartment in humans. Here, CD137+CD154- expression was described as Treg-specific activation signature after short-term reactivation. It was shown to identify prototypic stable Tregs that were characterized by a phenotypic and epigenetic Treg signature, high suppressive potential and lack of inflammatory cytokine expression. This Treg-specific activation signature enabled the purification of stable in vitro generated Tregs and also allowed for the rapid in vitro optimization of chimeric antigen receptor (CAR) constructs for human Tregs which revealed major differences in the signaling requirements compared to Tcons. In addition, antigen-specific responses against various antigens were dominated by prototypic CD137+CD154- Tregs and CD137-CD154+ Tcons with no overlapping TCR sequences indicating no major contribution of Treg-Tcon conversion to the Treg repertoire. In contrast, TCR overlap with Tcons was restricted to a minor CD137+CD154+ Treg subset with an epigenetically and transcriptionally intermediate Treg-Tcon phenotype whose function remains unknown. Nevertheless, CD137 and CD154 co-expression did not identify conversion, but a mixture of epigenetically imprinted Tregs and Tcons. Taken together, CD137+CD154- expression emerges as a universal Treg activation signature ex vivo and upon in vitro expansion allowing the identification and isolation of stable antigen-activated Tregs and providing a means for their rapid functional testing in vitro. Furthermore, it was shown that most human Tregs represent a highly stable cell lineage which contributes to in vivo immune reactions suggesting minor Treg instability and negligible peripheral Treg-Tcon conversion during the majority of human Treg responses in vivo. Consequently, stable CD137+CD154- Tregs emerge as important target for clinical applications and can contribute to the optimization of the efficacy and safety of therapeutic Tregs.
Regulatorische T Zellen (Tregs) sind wichtig für die Aufrechterhaltung von Toleranz und die Eindämmung von entzündlichen Immunreaktionen. Die suppressiven Eigenschaften von Tregs können zur Entwicklung von neuen Therapien zur Behandlung von entzündlichen Immunerkrankungen beitragen. Es wurde jedoch gezeigt, dass Tregs und konventionelle T Zellen (Tcons) ineinander übergehen können, was den Verlust oder auch die Induktion von regulatorischen Eigenschaften in vivo beinhaltet und die therapeutische Anwendung von Tregs, z.B. durch adoptiven Transfer aufgrund von Sicherheitsbedenken limitiert. Inwiefern diese Treg Plastizität zur Bildung und Stabilität des menschlichen Treg Kompartiments, als auch zu spezifischen Immunreaktionen in vivo beiträgt, bleibt unklar. Die therapeutische Anwendung von Tregs bedarf langer in vitro Expansion um ausreichende Zellzahlen zu erlangen oder um deren Funktionalität, z.B. durch genetische Veränderung der Antigenrezeptoren, zu optimieren. Die Reinheit der expandierten Kulturen ist jedoch höchst variabel, da es momentan kaum möglich ist stabile Tregs von kontaminierenden Tcons ex vivo oder nach in vitro Expansion zu unterscheiden. Ferner begrenzen solche Ungenauigkeiten die Entwicklung von Protokollen zur spezifischen Manipulation von Tregs. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit neue Marker für die eindeutige Identifizierung stabiler Tregs zu beschreiben welche zum einen zur verbesserten Wirksamkeit und Sicherheit von in vitro generierten Tregs beitragen können, als auch wichtige Einblicke in die Stabilität und Heterogenität des humanen Treg Kompartiments ermöglichen. Es wurde gezeigt, dass CD137+CD154- Expression nach kurzer Stimulation eine Treg-spezifische Aktivierungssignatur darstellt. Diese wurde auf stabilen Tregs exprimiert, welche eine phänotypische und epigenetische Treg Signatur sowie ein hohes suppressives Potential aufwiesen, jedoch keine pro-inflammatorischen Zytokine produzierten. Mithilfe dieser Treg-spezifischen Aktivierungssignatur konnten stabile Tregs aufgereinigt und chimäre Antigenrezeptoren (CARs) für Tregs in vitro optimiert werden, welche unterschiedliche Anforderungen bezüglich der Signaldomänen im Vergleich zu Tcons aufwiesen. Des Weiteren wurden antigen-spezifische Immunantworten gegen verschiedene Antigene von stabilen CD137+CD154- Tregs und CD137-CD154+ Tcons mit unterschiedlichen T Zell Rezeptor (TCR) Sequenzen vermittelt, welches die Abwesenheit von Treg-Tcon Übergängen im Treg Repertoire aufzeigte. Es wurde ebenfalls eine kleine CD137+CD154+ Treg Population detektiert, welche TCR Überlappung mit Tcon und eine intermediäre epigenetische und transkriptionelle Treg-Tcon Signatur aufwies, deren Funktion bisher nicht geklärt werden konnte. Diese Population identifizierte jedoch keine Übergänge, sondern eine Mischung aus stabilen Tregs und Tcons. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass CD137+CD154- Expression als universelle Treg Aktivierungssignatur die Identifizierung und Isolierung von stabilen antigen-aktivierten Tregs ex vivo und nach in vitro Expansion, sowie deren schnelle funktionelle Testung in vitro, ermöglichte. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die meisten menschlichen Tregs von einer stabilen Linie abstammen, welche zu Immunreaktionen in vivo beiträgt was ein nur geringes Aufkommen von Treg Instabilität und Treg-Tcon Übergängen aufzeigt. Dementsprechend kann eine gezielte Anwendung von CD137+CD154- Tregs die Wirksamkeit und Sicherheit von therapeutischen Tregs maßgeblich verbessern.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7476
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6699
Exam Date: 12-Feb-2018
Issue Date: 2018
Date Available: 27-Feb-2018
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): immunology
regulatory T cells
CAR-Treg
Treg therapy
Treg stability
Immunologie
regulatorische T-Zellen
Treg Therapie
Treg Stabilität
License: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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