Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6714
Main Title: Endophytes as source of polypeptide and polyketide antibiotics fengycin and bacillaene
Subtitle: process development for fengycin production
Translated Title: Endophyten als Quelle des polypeptiden Antibiotikums Fengycin und des polyketiden Antibiotikums Bacillaene
Translated Subtitle: Entwicklung eines Produktionsprozesses für Fengycin
Author(s): Glazyrina, Julia
Advisor(s): Neubauer, Peter
Referee(s): Neubauer, Peter
Götz, Peter
Meyer, Vera
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Endophytic bacteria, which populate plant tissues, can influence physiological processes in plants. They also have antagonistic effects against many phytopathogens. Utilization of these bacteria as a biological agent for protection of plants is an environmentally friendly alternative to chemical methods. Moreover, since plants belong to the eukaryotic organisms, antibiotics produced by endophytes may have reduced cell toxicity. Therefore, the antimicrobial compounds isolated from endophytes have a big potential for the pharmaceutical industry and agriculture. Potato plants were chosen as source of endophytes due to their ability to protect themselves from a broad spectrum of phytopathogens. Several bacterial strains having antifungal activities were isolated from potato tubers. One strain, which exhibited the strongest fungicide potential, was characterized and identified as Bacillus subtilis subsp. subtilis. It was deposited under the number DSM 21393 at the public collection of the DSMZ GmbH (Germany). The substances exhibiting antifungal activities were purified and after structure elucidation identified as the lipopeptide antibiotic fengycin. Due to its very strong fungicide as well as bactericide and anti-cancer properties this antibiotic has a good potential for applications in the pharmaceutical industry and agriculture. Furthermore, it exhibits strong surface active properties, which makes it of great interest as biosurfactant. Despite the great potential of lipopeptides, the industrial use of these antibiotics is still limited due to their high production costs, which result primarily from low strain productivity and difficulties in bioprocess design as well as downstream processing. Therefore, a further aim of this project was the development of a cost-effective production process for fengycin. Different complex substrates such as malt-, potato extracts and molasses as well as their mixtures were used as culture media. The maximum fengycin yield of 325mg/L was obtained in the optimized medium containing malt and potato extract. As the preparation of potato extract for a larger cultivation scale is not practicable, a side-product of starch production - potato fruit juice (PFJ) was used as an alternative. A fengycin yield up to 550mg/L could be achieved by applying this medium. The utilization of the medium containing malt extract and PFJ led not only to an enhanced fengycin yield but also reduced the production costs of fengycins. Moreover, during the purification experiments it was seen, that another antibiotic family called bacillaene was co-synthesized at high concentrations (up to 400mgL−1). This antibiotic having a broad spectrum of antibacterial activities belongs to the polyketide antibiotics. Other cultivation parameters such as temperature and inoculum quantity were shown to have influence on the cultivation process and fengycin yield. Moreover, it was shown, that the aeration strategy during cultivation was a crucial parameter influencing the production of both antibiotics fengycin and bacillaene. Thereby, a high aeration rate was favorable for bacillaene synthesis whereas the limited aeration rate induced and even could enhance fengycin synthesis rate. Moreover, process selectivity toward fengycin production could be increased from 37% up to 82% by decreasing the aeration rate. A key bottleneck for the application of lipopeptides on an industrial scale is the process development under extreme foam formation. In this project an in situ product removal (ISPR) strategy based on a foam collection was developed. The specialty of this system was the combination of foam fractionation with an adsorption-desorption process on polystyrene resins, which is more efficient than other commonly used ISPR techniques. Application of this ISPR technique not only allowed for a stable and efficient cultivation of B.subtilis DSM 21393 under intensive foaming conditions without the need to add anti-foam agents but also led to an increase in fengycin yield up to 1g/L. Using the developed ISPR strategy bacillaene yield could be also enhanced up to 550mg/L. Due to their low concentration, downstream processing of lipopeptides is relatively expensive. A novel cost-effective method based on a removal and separation of biosurfactants from the culture broth by compressing and harvesting of the liquid surface layer using a new device called Flounder was investigated. The Flounder can be efficiently applied for the separation and concentration of fengycin. The fengycin concentration in the collected fractions was found to be four times higher than in the culture centrifugate. A separation of fengycin from the less surface-active bacillaene could be achieved due to a stronger surface activity of fengycin. The process design for fengycin production from strain isolation via integration of an ISPR technique and production in 60L scale up to downstream of the target product was shown in this project. Thereby, the crucial production parameters for fengycin were determined. The proposed bioprocess development strategy could be easily adapted for the production of other lipopetides/biosurfactants.
Endophytische Bakterien besiedeln innere Pflanzengewebe und können physiologische Prozesse in den Pflanzen beeinflussen. Außerdem haben viele Endophyten antibiotische Wirkung gegen Phytopathogene. Damit stellen sie eine umweltfreundliche Alternative zu den chemischen Pestiziden dar und können als biologische Pflanzenschutzmittel eingesetzt werden. Da die Pflanzen eukariotische Organismen sind, könnten die von Endophyten produzierten Antibiotika eine niedrige Toxizität aufweisen. Dies alles macht diese Antibiotika sehr attraktiv für die Anwendung in der pharmazeutischen Industrie sowie in der Landwirtschaft. In diesem Projekt wurden Endophyten aus Kartoffelpflanzen isoliert. Die Tatsache, dass Kartoffelpflanzen sehr resistent gegen eine große Bandbreite von Phytopathogenen sind, macht diese zu einer interessanten Quelle von Endophyten. Es wurden mehrere bakterielle Stämme mit antifungaler Wirkung gegen verschiedene Pilze aus Kartoffelknollen isoliert. Ein Stamm, der das größte fungizide Potenzial aufwies, wurde charakterisiert und als Bacillus subtilis subsp.subtilis identifiziert. Dieser Stamm wurde unter der Nummer DSM 21393 bei der öffentlichen Stammsammlung der DSMZ GmbH (Deutschland) hinterlegt. Die von diesem Stamm produzierten antifungalen Substanzen wurden aufgereinigt und nach der Strukturaufklärung als das Lipopeptid-Antibiotikum Fengycin identifiziert. Dieses Antibiotikum hat neben sehr starker antifungizider auch antibakterielle und Antitumor-Aktivitäten. Außerdem weist Fengycin starke oberflächenaktive Eigenschaften auf, die es für die Anwendung als Biotensid attraktiv machen. Trotz des großen Potenzials dieser Lipopeptide ist ihre industrielle Anwendung sehr eingeschränkt. Die Hauptursachen dafür sind hohe Produktionskosten, die überwiegend durch eine niedrige Stammproduktivität, einen aufwendigen Bioproduktionsprozess sowie kostspielige Aufreinigung entstehen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war deswegen die Entwicklung eines kosteneffektiven Produktionsverfahrens für Fengycin. Als Kultivierungsmedien wurden verschiedene Substrate wie Malz-, Kartoffelextrakte und Melasse sowie Kombinationen von ihnen eingesetzt. Die maximale Fengycin-Ausbeute von 325mg/L wurde in einem optimierten Medium aus Malz- und Kartoffelextrakt erzielt. Da die Zubereitung von Kartoffelextrakt für einen größeren Kultivierungsmaßstab nicht praktikabel ist, wurde ein Nebenprodukt der Stärkeherstellung - Kartoffelfruchtwasser - als Alternative verwendet. Beim Einsatz dieses Mediums konnte eine Fengycin-Ausbeute von 550mg/L erzielt werden. Die Anwendung des Mediums aus Malzextrakt und Kartoffelfruchtwasser ermöglichte nicht nur eine erhöhte Fengycin-Ausbeute, sondern auch eine Reduzierung der Produktionskosten. Im Laufe der Aufreinigung wurde festgestellt, dass der isolierte Stamm B.subtilis DSM 21393 ein weiteres Antibiotikum, Bacillaene, in sehr hoher Konzentration (bis zu 400mg/L) synthetisiert. Dieses Antibiotikum gehört zu den Polyketidantibiotika und hat ein breites antibakterielles Spektrum. Desweiteren wurde gezeigt, dass andere Kultivierungsparameter wie Temperatur und Volumen des Inokulums das Kultivierungsverfahren und die Fengycin-Ausbeute beeinflussten. Außerdem wurde festgestellt, dass die Belüftungsstrategie ein entscheidender Parameter ist, der die Produktion von beiden Antibiotika, Fengycin und Bacillaene, sehr stark beeinflusst. Dabei zeigte eine hohe Belüftungsrate einen positiven Einfluss auf die Bacillaene-Synthese, während bei einer limitierten Belüftungsrate die Fengycin-Synthese induziert und sogar erhöht werden konnte. Darüber hinaus konnte die Prozessselektivität bei den niedrigen Belüftungsraten in Richtung Fengycin-Produktion von 37% auf 82% gesteigert werden. Die größte Herausforderung für die Prozessenwicklung von Fengycin im industriellen Maßstab ist die Prozessführung unter einer extremen Schaumbildung. In der vorliegenden Arbeit wurde eine in-situ-Strategie für die Produktabtrennung (ISPR), basiert auf der Abtrennung des Schaums, entwickelt. Die Besonderheit dieses Systems besteht in der Kombination von Schaumabtrennung mit der parallelen Adsorption von Fengycin auf einem Adsorberharz, welches diese Technik viel effizienter macht als andere Schaumabtrennungsverfahren. Die Anwendung dieser ISPR-Technik ermöglichte nicht nur eine stabile und effiziente Kultivierung von B.subtilis DSM 21393 unter intensiver Schaumbildung ohne Zusatz von Antischaummitteln sondern auch eine Steigerung der Fengycin-Ausbeute auf bis zu 1g/L. Die Ausbeute von Bacillaene konnte dabei bis auf 550mg/L erhöht werden. Niedrige Konzentrationen von produzierten Lipopeptiden stellen ein großes Problem bei dem Aufreinigungsprozess dar und verursachen hohe Kosten. Im Rahmen dieser PhD Arbeit wurde eine neue kostengünstige Methode unter Verwendung eines Gerätes namens "Flounder" für die Aufreinigung von Lipopeptiden untersucht. Das Aufreinigungsprinzip der "Flounder" basiert auf dem Komprimieren und anschließend Absaugen der Biotenside-Schicht. Es wurde gezeigt, dass diese Methode für die Abtrennung und Konzentrierung von Fengycin effektiv ist. Die Konzentration von Fengycin in den gesammelten Fraktionen war viermal höher als im Kulturüberstand. Dabei konnte Fengycin von dem weniger oberflächenaktiven Bacillaene abgetrennt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Prozessdesign für die Fengycinherstellung, von der Stammisolierung über die Integration der ISPR-Technik und die Produktion im 60L Maßstab bis hin zur Aufreinigung vom Zielprodukt, entwickelt. Alle wichtigen Prozessparameter für die Fengycinproduktion wurden dabei ermittelt. Die in dieser Arbeit vorgeschlagene Bioprozessstrategie könnte für die Herstellung von anderen Lipopeptiden/Biotensiden ohne großen Aufwand angepasst werden.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7491
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6714
Exam Date: 14-Nov-2017
Issue Date: 2018
Date Available: 2-Mar-2018
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): fengycin
bacillaene
lipopeptide
polyketide
process development
Prozessentwicklung
License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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