Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6878
Main Title: Growth rate dependent impact of oscillating glucose conditions on Escherichia coli physiology
Translated Title: Einfluss oszillierender Glukose Bedingungen auf die Escherichia coli Physiologie abhängig von der Wachstumsrate
Author(s): Brand, Eva
Advisor(s): Neubauer, Peter
Referee(s): Neubauer, Peter
Rappsilber, Juri
Schweder, Thomas
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Escherichia coli is the most used microorganism for biotechnological production processes due to its outstanding cultivation robustness and genetic and metabolic engineering possibilities. The established production process is a high cell density cultivation starting with a batch cultivation and followed by a fed-batch feeding strategy to avoid acetate accumulation and anaerobic conditions. The scale-up of a high cell density cultivation for increased productivity is accompanied with the appearance of heterogeneities in the cultivation broth especially regarding the substrate and oxygen distribution due to insufficient mixing when the cultivation mode changes from batch to fed-batch mode. These heterogeneities generally lead to a reduction in the specific production performance. To study the effect of heterogeneities on the Escherichia coli metabolism a scale-down reactor comprised of a stirred tank reactor in loop with a plug flow reactor was successfully established. The effect of heterogeneities, especially of oscillating glucose conditions, on the Escherichia coli metabolism are well studied for cultivations, where the cells are adapted to high glucose availability at batch phase and the growth rate decreases during transition to fed-batch strategy. In the present study the focus lies on the effect of oscillating glucose conditions on the Escherichia coli metabolism, when the cells are primarily adapted to low glucose availability and reduced growth rate. Therefore, a cultivation process was established with an internal, enzyme-based fed-batch before the start of oscillating glucose conditions (referred to as mechanical feeding). This cultivation process was compared in terms of cell growth, general cultivation parameters and accumulation of organic and amino acids to reference cultivation process without oscillating glucose conditions and to a cultivation with initial batch mode. Additionally, the proteome and selected transcriptome was analyzed for the newly established cultivation process and its reference cultivation. The growth rate and glucose availability before the onset of oscillating glucose conditions was found to have an immediate effect on the accumulation of organic acids and amino acids in the stirred tank of the scale-down reactor. Though organic acids accumulated along the plug flow reactor at oscillating glucose conditions for cells adapted to high and low growth rate, the re-assimilation was found to be reduced for the latter. 5 h of oscillating glucose conditions were not sufficient to synchronize the accumulation pattern of both cultivations. Proteome data show, that the increase in growth rate during transition from enzyme based fed-batch to mechanical fed-batch with oscillating glucose condition leads to a level decrease of protein involved in biosynthesis pathways. The increased growth rate caused more level changes of proteins of the central carbon metabolism and synthesis pathways for amino acids and nucleotide precursors than oscillating glucose conditions. In fact, the adaptation to oscillating glucose conditions for the newly established cultivation process compared to its reference stirred tank reactor cultivation on the proteome level was mainly found in the activation of the glyoxylate shunt and increase in two of four respiration complexes. This study shows, that the physiological status of the Escherichia coli cell before the change of cultivation parameter can have an important effect on its central metabolism and performance due to prolonged adaptation processes.
Escherichia coli ist aufgrund seiner herausragenden Kultivierungseigenschaften sowie den weitreichenden Möglichkeiten der genetischen und metabolischen Anpassung das am häufigsten verwendete Bakterium für biotechnologische Produktionsprozesse. Dabei ist der etablierte Produktionsprozess eine Hochzelldichtekultivierung, die mit einem Batch-Ansatz startet. In der Folge wird eine Fed-Batch Fütterungsstrategie angewendet, um die Akkumulation von Azetat und anaerobe Bedingungen zu vermeiden. Die maßstabsgerechte Vergrößerung einer Hochzelldichtekultivierung für erhöhte Produktivität führt zu der Entstehung von Heterogenitäten in der Kultivierungsbrühe. Diese betreffen speziell die Substrat- und Sauerstoffverteilung aufgrund unzureichender Durchmischung, wenn von einer Batch Kultivierung auf eine Fed-batch Kultivierung umgestellt wird. Heterogenitäten führen generell zu einer verringerten spezifischen Produktionsleistung. Um den Effekt von Heterogenitäten auf den Escherichia coli Stoffwechsel zu untersuchen, wurde ein Scale-Down Reaktor, bestehend aus einem Rührtankreaktor verbunden mit einem Pfropfenstromreaktor, erfolgreich etabliert. Der Effekt von Heterogenitäten, speziell von oszillierenden Glucosepulsen, auf den Escherichia coli Stoffwechsel, ist bereits gut für Kultivierungen untersucht, in denen die Zellen an hohe Glukosekonzentration der Batchphase angepasst sind, und die Wachstumsrate während des Übergangs zum Fed-batch sank. In dieser Studie liegt der Fokus auf dem Effekt von oszillierenden Glukosepulsen auf den Escherichia coli Stoffwechsel, wenn die Zellen zuvor an eine geringe Glukosekonzentration und reduzierte Wachstumsrate angepasst sind. Dazu wurde ein Kultivierungsprozess mit einem enzymbasierten Fed-batch vor dem Beginn der oszillierenden Glukosepulse etabliert (gleichbedeutend mit mechanischer Fütterung). Dieser Kultivierungsprozess wurde in Bezug auf Zellwachstum, allgemeine Kultivierungsparameter und Akkumulation organischer Säuren und Aminosäuren mit einer Referenzkultivierung ohne oszillierende Glukosepulse und mit einer Kultivierung mit anfänglicher Batch Kultivierung verglichen. Zusätzlich wurde das Proteom und ausgewählte Teile des Transkriptoms im neu etablierten Kultivierungsprozesses und der Referenzkultivierung untersucht. Die Wachstumsrate und Glukoseverfügbarkeit vor dem Start der oszillierenden Glukosepulse haben einen unmittelbaren Effekt auf die Akkumulation organischer Säuren und Aminosäuren im Rührkessel Reaktor des Scale-Down Reaktors. Obwohl organische Säuren entlang des Pfropfenstromreaktors sowohl in den Kulturen, die an hohe oder geringe Wachstumsrate präadaptiert wurden, akkumulierten, war die Reassimilation bei letzteren geringer. Fünf Stunden oszillierende Glukosepulse waren nicht ausreichend, um das Akkumulationsmuster beider Kultivierung anzugleichen. Weiterhin zeigen Proteomdaten, dass die Erhöhung der Wachstumsrate während des Übergangs von enzymbasiertem Fed-batch zum mechanischen Fed-batch mit oszillierenden Glukosepulsen zu einer Verringerung der Menge an Proteinen führt, die an zentralen Biosynthesewegen beteiligt sind. Die Erhöhung der Wachstumsrate verursachte wesentlich mehr Konzentrationsänderungen von Proteine des zentralen Kohlenstoffwechsels und der Synthesewege für Aminosäuren und Nukleotidvorläufern als oszillierende Glukosepulse. Tatsächlich beruht die Anpassung an oszillierende Glukosepulse für den neu etablierten Kultivierungsprozess verglichen mit der Rührtankreaktor Kultivierung als Referenz bezüglich des Proteoms hauptsächlich in der Aktivierung des Glyoxylatzyklus und der Erhöhung von zwei von vier Atmungs-Komplexen. Diese Studie zeigt, dass der physiologische Status von Escherichia coli Zellen in der initialen Kultivierungsphase aufgrund langer Anpassungsprozesse einen bedeutenden Effekt auf den zentralen Kohlenstoffwechsel und Leistungsfähigkeit in der folgenden Fed-batch Phase haben kann.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7700
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6878
Exam Date: 21-Sep-2017
Issue Date: 2018
Date Available: 27-Apr-2018
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Escherichia coli physiology
substrate heterogeneities
two-compartment reactor
scale-down
proteome analysis
Escherichia coli Physiologie
Substratheterogenitäten
Zwei-Kompartimenten Reaktor
Maßstabsverringerung
Proteomanalyse
License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Is Supplemented By: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6618
Appears in Collections:FG Bioverfahrenstechnik » Publications

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
brand_eva.pdf7.02 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons