Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6921
Main Title: Spectroelectrochemical study of biomolecules in artificial membrane systems
Translated Title: Spektro-elektrochemische Studie von Biomolekülen in künstlichen Membransystemen
Author(s): Gonzalez, Barbara Daiana
Advisor(s): Hildebrandt, Peter
Referee(s): Hildebrandt, Peter
Weidinger, Inez
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: This work presents a spectroeletrochemical approach combining electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and surface-enhanced infrared absorption (SEIRA) spectroscopy to characterise the interaction of proteins and peptides with model membranes. The artificial membrane systems are assembled on a nanostructured Au-film, which is deposited on an attenuated total reflectance (ATR) crystal as a prerequisite for the enhancement of the IR signals of the immobilised molecules. The Au-film also serves as working electrode to control and vary the potential across the immobilised membrane model. Here, a nanodisc system was employed to investigate the membrane protein channelrhodopsin II (ChR II), while tethered bilayer lipid membrane (tBLM) systems were used to characterise the antimicrobial peptides enniatin B (EB) and arenicin 1 (A1). For the first time, the light-induced structural changes of the “slow” C128S mutant of the light-gated ion channel ChR II embedded into nanodisc systems were observed by SEIRA spectroscopy. The nanodisc systems containing zwitterionic lipids and His-tag tails were successfully immobilised using the Ni-NTA (nitrilotriacetic acid) monolayer. The spectral changes were assigned to structural variations of the protein backbone associated to the transition from the dark state to the P390 intermediate. This proof-of-principle study demonstrates that nanodisc represent a promising system to study the retinal protein ChR II. Characterisation of EB peptide by SEIRA spectroscopy was performed using a 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, zwitterionic lipids) tBLM system. The unprecedented results, provide a comprehensive evaluation of EB incorporation in membrane systems in the presence of monovalent cations, as well as a new understanding of EB:ion complex formation. The spectral features of EB ligand groups in presence of K+ ion, demonstrated that the K+ complex significantly differs from the species formed in the presence of Na+ and Cs+ ions, which are spectroscopically alike. These findings disagree with previous studies, and contribute to the controversial discussion of EB:ion complex stoichiometry assignment. Finally, tBLMs containing 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] (sodium salt) (POPG) negatively charged lipids were employed for characterising the membrane binding of the cationic peptide A1. The unique structure of A1 and its potential-dependent activity were investigated by SEIRA spectroscopy. The β-sheet folding exhibited high stability in different environments (solid, solution and membrane) and temperatures. The highest activity was recorded at 37° C upon application of negative potentials (-400 mV). Overall, A1 significantly disturbed the lipid membrane in a non-reversible manner. The EIS and SEIRA spectroscopy results were complemented with UV-vis, ATR-IR, FT-IR transmission spectroscopy, as well as theoretical calculations, allowing a sound structure-function insight. The high reproducibility and stability of the membrane systems, together with the specific results for the target biomolecules, have shown that EIS and SEIRA spectroscopy are powerful tools for the structural and functional study of biomolecules and their interaction with model membranes.
Die vorliegende Arbeit beschreibt einen spektro-elektrochemischen Ansatz, in welchem elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) und oberflächenverstärkte Infrarotabsorptions-Spektroskopie (surface-enhanced infrared absorption, SEIRA) zur Charakterisierung der Interaktion zwischen Proteinen und Peptiden mit Model-Membranen kombiniert wurden. Die künstlichen Membransysteme wurden auf einen nanostrukturierten Au-Film adsorbiert, der auf einem Abgeschwächte Totalreflexion (attenuated total reflectance) ATR-Kristall als Voraussetzung für die Verstärkung des Infrarotsignals der immobilisierten Moleküle aufgebracht wurde. Die Au-Schicht dient ebenso als Arbeitselektrode und erlaubt die Kontrolle und Veränderung des Potentials an der immobilisierten Membran. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Nanodisc-System zur Untersuchung des Membranproteins Kanalrhodopsins II (ChR II) genutzt, während zur Analyse der antimikrobiellen Peptide Enniatin B (EB) und Arenicin 1 (A1) Oberflächen-adsorbierte Lipiddoppelschichtmembransysteme (tethered bilayer lipid membrane, tBLM) verwendet wurden. Die licht-induzierten strukturellen Änderungen der „langsamen“ C128S-Mutante des licht-gesteuerten Ionenkanals ChR II eingebettet in einem Nanodisc-System wurden zum ersten Mal mit SEIRA-Spektroskopie gezeigt. Das Nanodisc-System, bestehend aus zwitterionischen Lipiden, wurde mit einem terminalen His-Tag erfolgreich an eine Nickel-Nitrilotriessigsäure-Monolage (Nit-NTA) immobilisiert. Die spektralen Änderungen ordneten man der strukturellen Unterschiede des Proteinrückrats zu. Diese erfolgen beim Übergang des Dunkelzsutandes zum P390 Intermediat. Hierbei wurde gezeigt, das Nanodiscs ein vielversprechendes System zur Untersuchung des Retinalproteins ChR II sind. Charakterisierung des EB Peptids mittels SEIRA Spektroskopie erfolgte unter der Verwendung von einem 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, zwitterionische Lipide) tBLM System. Die neuartige Erkenntnisse bieten eine umfassende Auswertung des EB Einbaues in Membran-Systeme bei der Anwesenheit von monovalenten Kationen sowie der EB:Ion-Komplexbildung. Die spektralen Merkmale der EB-Ligandengruppen in Anwesenheit eines K+-Ion zeigten, dass der K+-Komplex Unterschiede im Gegensatz zur Na+- und Cs+-Spezies aufweist. Diese Ergebnisse wiedersprechen vorherige Untersuchungen, dadurch tragen sie zur kontroversen Diskussion der stöchiometrischen Zuordnung des EB:Ion-Komplexes. Abschließend wurden tBLM-Systeme, bestendend aus 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] (POPG als Natriumsalz) negativ geladenen Lipide, zur Untersuchung des kationischen Peptids A1 eingesetzt. Die einzigartige A1 Peptidstruktur und deren Potential-Abhängigkeit wurden mittels SEIIRA-Spektroskopie untersucht. Die β-Faltblattstruktur zeigte höhe Stabilität in verschiedenen Umgebungen (fester Zustand, Lösung und Membran) und Temperaturen. Die höchste Aktivität wurde bei 37 °C und einem negativen Potential (-400 mV) nachgewissen. Insgesamt wurde eine irreversible Störung der Membran beobachtet. Die Ergebnisse der EIS und SEIRA spektroskopischen Untersuchungen wurden mit UV-VIS, ATR-IR und FT-IR Transmission, sowie theoretischen Berechnungen ergänzt, dadurch wurde einen aussagekräftigen Einblick der Struktur-Funktion-Beziehung erreicht. Die gute Reproduzierbarkeit der Experimente und Stabilität des Membransystems haben zusammen mit den getroffenen Aussagen zu den untersuchten Molekülen bewiesen, dass EIS und SEIRA Spektroskopie aussagekräftige Werkzeuge zur strukturellen und funktionellen Betrachtung der Wechselwirkung von Biomolekülen mit Model-Membranen darstellen.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/7743
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-6921
Exam Date: 28-Sep-2017
Issue Date: 2018
Date Available: 4-May-2018
DDC Class: 541 Physikalische Chemie
Subject(s): spectroscopy
SEIRA
tBLM
peptides
membrane
Spektroskopie
Peptide
Membran
License: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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