Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-7272
Main Title: Monitoring of the single-cell morphology for the evaluation of microbial eukaryotic bioprocesses
Translated Title: Monitoring der Einzelzellmorphologie zur Bewertung mikrobieller eukaryotischer Bioprozesse
Author(s): Marbà Ardébol, Anna Maria
Advisor(s): Neubauer, Peter
Referee(s): Neubauer, Peter
Delvigne, Frank
Pollmann, Erik
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Cell morphology is not only influenced by the cell cycle, the aging or individual properties, but also by environmental impacts such as those occurring on a large-scale. Cell morphology can be a suitable parameter for in situ measurements as it changes dynamically and is often related to cell physiology. In order to be able to identify relationships between cell physiology and morphology, statistically representative amounts of data have to be measured. It should be considered that the behaviour of cells is not only dynamic, but also very sensitive to environmental changes. Therefore, off line measurements may not be suitable for detecting small changes in the morphological properties. Sampling and sample preparation would conceal this, apart from an often insufficient number of data or an unreasonable amount of time and effort. Among the techniques that are able to capture the morphological characteristics of cells in real-time, automated imaging technologies are promising, because they provide additional information about cellular structures, shape and cell aggregation beyond size. Photo-optical in situ microscopy (ISM) and three-dimensional holographic microscopy (DHM) were used in this study to measure the morphological dynamics in eukaryotic cultures on a single-cell basis, using heterotrophic algae and yeast as examples. The intracellular concentration of the polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid (DHA) in the heterotrophic algae Cryptecodinium cohnii was monitored. A second order correlation between the DHA content as measured off line chromatographically and the prediction using the average Sauter diameter was found. A different media composition did not only influence the cell size, but also the circularity and phase homogeneity of the algae cells. Consequently, different chloride ion substitutes were tested with respect to the cell growth and lipid accumulation in C. cohnii. Multi-compartment reactors were used to investigate the influence of gradients, as they occur in a large-scale, on the morphological heterogeneity in Saccharomyces cerevisiae cultures. Contrary to expectations, the sterol synthesis was positively influenced by oscillatory oxygen availability (ergosterol ester concentrations increased by 75 %), although microbial growth was decreased (the biomass concentration was reduced by 20 %). Budding of yeast was monitored in batch cultivation using ISM. A narrow size distribution was measured during the growth phase while the population homogeneity increased. If glucose was depleted, the percentage of non-budding cells remained almost constant due to a significant reduction in growth activity. The ratio of budding and total cells was successfully applied to differentiate between the different growth stages. The methods proved to be suitable for monitoring morphological properties over a relevant concentration range. Faster particle identification, including overlapping particles, and further investigations to better understand the relations between the shape and state of a cell will allow the technology to be used to control a variety of bioprocesses.
Die Zellmorphologie wird nicht nur durch den Zellzyklus, die Alterungs- oder individuelle Eigenschaften beeinflusst, sondern auch durch Umweltbelastungen, wie sie z.B. im großen Maßstab auftreten. Die Zellmorphologie kann ein geeignete Parameter für eine in situ Messung sein, da sie sich dynamisch verändert und dabei oft mit der Zellphysiologie zusammenhängt. Um Beziehungen zwischen der Zellphysiologie und Morphologie identifizieren zu können, müssen statistisch repräsentative Datenmengen gemessen werden. Zu Berücksichtigen ist, dass das Verhalten der Zellen dabei nicht nur extrem dynamisch ist, sondern auch sehr sensibel gegenüber Umweltveränderungen. Daher können off line Messungen ungeeignet sein, kleinere Änderungen in den morphologischen Eigenschaften zu detektieren. Die Probenahme und in der Regel die Probenvorbereitung würde diese überdecken, abgesehen von einer oft nicht ausreichenden Anzahl von Daten oder eines nicht vertretbaren Aufwandes. Unter den Techniken, die in der Lage sind, morphologische Merkmale von Zellen zeitnah zu erfassen, sind automatisierte Bildgebungstechnologien vielversprechend, da sie über die Größe hinaus weitere Informationen über zelluläre Strukturen, Form und Zellaggregation liefern. Die photo-optische in situ Mikroskopie (ISM) und die drei-dimensionale holographische Mikroskopie (DHM) wurden in dieser Studie zur Messung der morphologischen Dynamik in eukaryontischen Kulturen auf Einzelzellbasis eingesetzt, die exemplarisch an heterotrophen Algen und Hefe untersucht wurde. Die intrazelluläre Konzentration der mehrfach ungesättigten Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) in der heterotrophen Alge Cryptecodinium cohnii wurde überwacht. Eine Korrelation zweiter Ordnung zwischen dem DHA-Gehalt, wie er off line chromatographisch gemessen wurde, und der Vorhersage unter Verwendung des Durchschnitts des Sauter-Durchmessers konnte gefunden werden. Eine unterschiedliche Medienzusammensetzung beeinflusste nicht nur die Zellgröße, sondern auch die Zirkularität und Phasenhomogenität der Algenzellen. Folglich wurden verschiedene Chloridionenersatzstoffe hinsichtlich des Zellwachstums und der Lipidakkumulation in C. cohnii getestet. Mehrkompartimenten-Reaktoren wurden eingesetzt, um den Einfluss von Gradienten, wie sie im großen Maßstab auftreten, auf die morphologische Heterogenität innerhalb von Saccharomyces cerevisiae Kulturen zu untersuchen. Insbesondere wurden die Auswirkungen von Sauerstofflimitierungen auf die Zellheterogenität untersucht. Entgegen den Erwartungen wurde die Sterolsynthese durch die oszillatorische Sauerstoffverfügbarkeit positiv beeinflusst (die Ergosterolesterkonzentrationen stiegen um 75 %), obwohl sich das mikrobielle Wachstum verlangsamte (die Biomassekonzentration war um 20 % erniedrigt). Darüber hinaus wurde die Knospung der Hefe mit Hilfe der ISM auf Einzelzellebene in Batchkultivierungen überwacht. Die Größenverteilung wurde während der Wachstumsphase enger, so dass die Populationshomogenität zunahm. War die Glukose verbraucht, blieb der Prozentsatz der Nicht-knospenden Zellen aufgrund einer stark verminderten Wachstumsaktivität nahezu konstant. Anhand des Anteils knospender Zellen konnte zwischen den verschiedenen Kultivierungsstadien unterschieden werden. Die gezeigten Methoden erwiesen sich als geeignet zur Überwachung morphologischer Eigenschaften über einen relevanten Konzentrationsbereich hinweg. Eine schnellere Partikelidentifizierung, auch von überlappenden Partikeln, und weitere Untersuchungen zu einem besseren Verständnis der Zusammenhänge zwischen Form und Zustand einer Zelle wird den Einsatz der Technologie zur Kontrolle einer Vielzahl an Bioprozessen erlauben.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/8111
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-7272
Exam Date: 19-Mar-2018
Issue Date: 2018
Date Available: 17-Aug-2018
DDC Class: 620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten
Subject(s): Cryptecodinium cohnii
Saccharomyces cerevisiae
population heterogeneity
three-dimensional digital holographic microscopy
photo-optical in situ microscopy
Populationsheterogenität
drei-dimensionale holographische Mikroskopie
photo-optische in situ Mikroskopie
Sponsor/Funder: BMEL, 511-06.01-28-1-73.026-10, FENA − fishmeal and oil feed substitutes for a sustainable aquaculture
BMWi, ZF 4184201CR5, Smart Process Inspection
License: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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