Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-7291
Main Title: In vivo-Analyse der B-Zell-Rezeptor-Signaltransduktion im Keimzentrum
Subtitle: neue Einblicke in die Affinitätsreifung durch Intravitalmikroskopie
Translated Title: In vivo analysis of B cell receptor signaling in germinal centers
Translated Subtitle: new insights into affinity maturation via intravital microscopy
Author(s): Ulbricht, Carolin
Advisor(s): Hauser, Anja Erika
Referee(s): Hauser, Anja Erika
Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: de
Abstract: Unser Immunsystem stellt uns eine Vielzahl von Effektormechanismen zur Verfügung, die für den lebenslangen Schutz vor Krankheitserregern sorgen. Ein Aspekt dieser Mechanismen ist die Produktion von Immunglobulin-Antikörpern durch langlebige Plasmazellen, die aus B-Zellen in Keimzentren der sekundären lymphatischen Organe stammen. Innerhalb der Keimzentren bilden B-Zellen, T-Zellen und follikuläre dendritische Zellen stabile Kontakte, die für einen Prozess, der Affinitätsreifung genannt wird, unerlässlich sind. Diese Kontakte führen zum Erwerb des Antigens aus follikulären dendritischen Zellen durch B-Zellen, zu kognitiven T-Zell-B-Zell-Interaktionen, die das Überleben von affinen B-Zell-Klonen sichern, und schließlich zur Rezirkulation von B-Zellen innerhalb bestimmter Zonen des Keimzentrums. Während der Rezirkulation nimmt die Antigen-Affinität der membrangebundenen Form des Immunglobulins, des B-Zell-Rezeptors, durch akkumulierte Mutationen in den Immunglobulin-Genen stetig zu. In der Keimzentrumsreaktion kommen ihm zwei Rollen zu: Er ist verantwortlich für die Aufnahme des Antigens und überträgt Signale ins Innere der Zelle. So könnte die Affinität des B-Zell-Rezeptors neben der Erleichterung der Antigenaufnahme auch eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion spielen, eine Rolle des Keimzentrums-B-Zell-Rezeptors, die schon lange in der Diskussion steht. Wir zeigen hier, dass durch die Stimulation des B-Zellrezeptors der Calciumeinstrom in B-Zellen initiiert wird und die Calciumkonzentration mit der Zeit und mit der Affinität des Rezeptors zum Antigen ansteigt. Zur Überwachung der Signaltransduktion durch B-Zell-Rezeptoren in vivo haben wir einen neuartigen transgenen Reporter-Mausstamm namens YellowCaB entwickelt, der das calciumempfindliche Förster-Resonanzenergietransfer-Sensorprotein TN-XXL in CD19+ B-Zellen exprimiert. Mithilfe der intravitalen Zweiphotonenmikroskopie sind wir erstmals in der Lage, das Signaling von B-Zell-Rezeptoren zeitlich und räumlich im lebenden Organismus zu analysieren und gleichzeitig Zell-zu-Zell-Interaktionen und Migration zu untersuchen. Unser System erhält dabei die naturgegebenen Strukturen des Gewebes, was so in Kultur nicht machbar wäre. Darüber hinaus bietet uns die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung die Möglichkeit, Calciumkonzentrationen mit Entscheidungen über das Zellschicksal in Beziehung zu setzen. Mit dieser Methode konnten wir zeigen, dass naive und antigenspezifische B-Zellen innerhalb und außerhalb von Keimzentren eine differentielle Faltung von TN-XXL (und damit Calciumkonzentration) aufweisen. Die Beobachtung von kolokalisierten B-Zellen, die mit dem Calciumzufluss in einem der Reaktionspartner zusammenfiel, führte zu der Hypothese, dass neben follikulären dendritischen Zellen auch B-Zellen selbst eine Quelle der Stimulation von B-Zell-Rezeptoren sind. Zusammen mit CD40L-Signalen von T-follikulären Helferzellen und Signalen, die von Toll-ähnlichen Rezeptoren stammen, wird der B-Zell-Calciumspiegel streng reguliert, um das Ergebnis der Keimzentrumsreaktion zu kontrollieren. Die terminale Differenzierung könnte eine direkte Folge der Aufsummierung dieser Signale sein. Um dies zu unterstützen, konnten wir zeigen, dass B-Zellen in der Lage sind, auf äußere Reize mehrmals durch Calciumzufuhr ohne Erschöpfung zu reagieren. Zusammengefasst stellen wir hier einen neuen Wirkmechanismus für B-Zellen vor, die an der Keimzentrumsreaktion teilnehmen und ihr eigenes Schicksal rückkoppeln. Daher ist das Signaling von B-Zell-Rezeptoren ein wesentlicher Bestandteil der B-Zell-, Plasmazell- und Gedächtnis-B-Zell-Entwicklung.
Our immune system provides us with a variety of effectors that account for life-long protection against pathogens. One aspect of this mechanism is the production of antibodies by long-lived plasma cells that derive from B cells of germinal centers within secondary lymphoid organs. Within germinal centers, B cells, T cells and follicular dendritic cells form stable contacts that are essential for a process called affinity maturation. These contacts lead to acquisition of antigen from follicular dendritic cells by B cells, cognate T cell-B cell interactions that ensure survival of B cell clones and finally to the recirculation of B cells within distinct zones of the germinal center. During recirculation, the membrane-bound form of immunoglobulin, the B cell receptor, becomes increasingly affine to the antigen thanks to accumulating mutations in the immunoglobulin genes. The B cell receptor is not only responsible for antigen uptake but is also able to transduce signals to inner parts of the cell. Thus, apart from its facilitating antigen uptake, affinity of the B cell receptor might play a pivotal role in signaling as well, a role of the germinal center B cell receptor that has long been up for discussion. We here show that B cell receptor signaling-related Calcium influx is active in a subset of germinal center B cells and that calcium concentration is increasing over time and with affinity of the receptor to the antigen. To monitor B cell receptor signaling in vivo we developed a novel transgenic reporter mouse strain termed YellowCaB that expresses the calcium sensitive Förster Resonance Energy Transfer sensor protein TN-XXL in CD19+ B cells. Employing intravital two-photon microscopy, we are the first group to be able to spatiotemporally resolve B cell receptor signaling in living organisms, while simultaneously monitoring cell-to-cell interactions and migration. This allows us to preserve the natural architecture of the tissue, what otherwise would not have been possible in culture systems. Furthermore, fluorescence lifetime imaging is offering us the possibility to relate calcium concentrations to cell fate decisions, as we could show that naive and antigenspecific B cells inside and outside germinal centers show distinct quenching of TN-XXL. The observation of colocalized B cells that coincided with calcium influx in one reaction partner led us to hypothesize that apart from follicular dendritic cells, B cells itself are a source of B cell receptor stimulation via complement receptors. Together with CD40L-signals from T follicular helper cells and signals stemming from Toll like receptor engagement, the B-cellular calcium level is tightly regulated to control the outcome of the germinal center reaction. Terminal differentiation might be a direct downstream result of these signals adding up. To support this, we could show that B cells are able to react to external stimuli several times via calcium influx without exhaustion. Taken together, we here present a new mode of action for B cells taking part in the germinal center reaction and feedbacking their own fate. Thus, B cell receptor signaling is an essential part of B-cell-, plasma cell- and memory B cell development.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/8130
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-7291
Exam Date: 13-Jul-2018
Issue Date: 2018
Date Available: 27-Aug-2018
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Keimzentrum
B-Zellen
Affinitätsreifung
Calcium
Signaltransduktion
germinal center
B cells
affinity maturation
calcium
signaling
License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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