Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-557
Main Title: Untersuchungen zu Struktur und Funktion eines Porenproteins der äußeren Chloroplastenmembran
Translated Title: Investigations on structure and function of a pore protein of the outer chloroplast membrane
Author(s): Linke, Dirk
Advisor(s): Fromme, Petra
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: In der vorliegenden Arbeit wurde die biophysikalischen Eigenschaften eines kleinen Kanalproteins aus der äußeren Chloroplastenmembran der Erbse, genannt OEP16 ( outer envelope Protein 16 kDa ), untersucht und ein neues Strukturmodell entwickelt, auf dessen Basis die Funktion des Proteins mit molekularbiologischen Methoden nun genauer erforscht werden kann. OEP16 ist ein Membranprotein mit ungewöhnlichen Eigenschaften. Als Protein der äußeren Chloroplastenmembran insertiert es selbständig in geeignete Lipiddoppellschichten und in Detergenzmizellen. Bei vielen eukaryontischen Membranproteinen kommt eine bakterielle Überexpression zur Gewinnung großer Proteinmengen nicht in Frage, da zumeist ein korrekter Einbau in eine Membran mangels der komplexen eukaryontischen Faltungsmaschinerie in diesen Systemen nicht gegeben ist. OEP16 hingegen erlaubt es, aufgrund seiner selbsttätigen Renaturierung das Protein ohne Rücksicht auf die native Struktur in E.coli überzuexprimieren und erst anschließend rückzufalten. Es konnte gezeigt werden, daß man große Mengen korrekt gefalteten Proteins erhalten kann, indem man in chaotropen Puffersystemen aufgereinigtes Protein durch einen Verdünnungsschritt in einen detergenzhaltigen Puffer überführt. Der Nachweis, daß sich OEP16 in Detergenzmizellen in eine native Form faltet, ist schwierig, da die Funktion des Proteins, seine Kanalaktivität, nur in einem Membransystem meßbar ist. Durch den Vergleich von Fluoreszenz- und CD-Spektren von detergenzhaltigen Proteinlösungen und dem in Liposomen eingebautem Protein (mit nachgewiesener Funktionalität) konnte gezeigt werden, daß die Struktur von OEP16 in den auf unterschiedliche Weise rekonstituierten Proben übereinstimmte. Zeitaufgelöste Messungen mit denselben spektroskopischen Methoden lieferten Daten über den Verlauf und die Geschwindigkeit der Proteinfaltung bei dieser Renaturierungsmethode, einschließlich der Aktivierungsenergien für den Prozeß. Kalorimetrische Messungen (DSC) erlaubten eine Abschätzung der Faltungsenthalpie. Durch hochauflösende CD-Messungen und Infrarotspektroskopie wurde schließlich am in vitro gefalteten Protein gezeigt, daß es sich bei OPE16 entgegen bisheriger Voraussagen um ein rein alpha-helikales Membranprotein handelt. Dieser Befund konnte durch theoretische Methoden der Strukturbestimmung bestätigt werden. Ein neues Strukturmodell wurde erstellt. Erste vielversprechende Ansätze der Proteinkristallisation und der Elektronenmikroskopie zeigen, daß eine detaillierte Struktur von OEP16 in absehbarer Zeit erhältlich sein könnte. Dies wäre weltweit die erste hochaufgelöste Struktur eines im Reagenzglas gefalteten Membranproteins. In einer Zeit, in der Proteomics, also das Überexprimieren und Analysieren von Proteinen, die Arbeit der größtenteils abgeschlossenen Sequenzierungprojekte fortführen sollen, konnte mit OEP16 ein Modellsystem für die detaillierte Struktur- und Funktionsanalyse von Membranproteinen etabliert werden.
In this work, the biopysical properties of OEP16 (outer envelope protein 16 kDa) were investigated. A new structural model was developed. On the basis of this model, the function of the channel protein OEP16 can be further investigated. OEP16 is a channel protein with unusual properties. As a protein of the outer chloroplast membrane, it has the abitity to insert itself into the lipid bilayer spontaneously. For most eucaryotic membrane proteins, overexpression in E.coli is out of the question, because they cannot be folded into their correct conformation as bacteria lack the complex folding apparatus of eucaryotes. OEP16 on the other hand can be isolated in a denatured state and can then be refolded in vitro. It could be shown that large amounts of correctly folded protein can be obtained by diluting OEP16 prepared in a chaotropic puffer system with a detergent buffer. It is difficult to show the active conformation of OEP16 as its channel properties cannot be measured in solution. By comparing fluorescence and CD spectra of samples prepared with detergents and in liposomes (where the functionality of the protein can be monitored), it was proven that the conformations in the different preparations were identical. Time-resolved measurements with the same spectroscopic detection methods provided data on the process of protein folding, including the folding velocity and activation energies of several separate partial processes. Calorimetric experiments allowed to estimate the folding enthalpy. High resolution CD end FTIR spectra of the folded protein showed OEP16 to be a purely alpha-helical protein, in contrast to earlier structural models. This finding was confirmed by theoretical methods that allowed to propose a new structural model. First experiments with protein crystallograpy and electron microscopy suggest that it is possible to get to a detailed structure of OEP16 within a relatively short time. This would be the first high resolution structure of a membrane protein refolded in vitro. In a time when proteomics, the overexpression and analysis of proteins on a large scale, more and more replace or continue the work of world wide DNA sequencing projects, OEP16 is a model system for detailed structural and functional analysis of eucaryotic membrane proteins.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-4596
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/854
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-557
Exam Date: 10-Jul-2002
Issue Date: 18-Jul-2002
Date Available: 18-Jul-2002
DDC Class: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Subject(s): Chloroplast
Membranprotein
Proteinfaltung
Rekonstitution
Strukturaufklärung
Chloroplast
Membrane protein
Protein folding
Reconstitution
Structure determination
Usage rights: Terms of German Copyright Law
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