Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-7865
Main Title: Untersuchungen zur Biosynthese von Omphalotin
Translated Title: Studies towards the biosynthesis of Omphalotin
Author(s): Ramm, Sascha
Advisor(s): Süßmuth, Roderich
Referee(s): Süßmuth, Roderich
Dittmann, Elke
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: de
Abstract: Originally discovered in 1987, Omphalotin is an undodecapeptide (which is) synthesized by the basidiomycete Omphalotus olearius. The fungal secondary metabolite shows a strong nematicide and selective activity against the plant parasite Meloidogyne incognita. Structurally, it bears various remarkable characteristics, as for example nine methylations of the α-nitrogen atoms in the peptide backbone. Despite the nematicide peptide and its structure being discovered almost 30 years ago, the biosynthetic mechanism still remains unknown. In this study, a gene cluster was identified which is potentially responsible for the biosynthesis of Omphalotin. It contains genes encoding for a prolyl oligopeptidase (OphP) and a fusion protein OphMA, the latter consisting of a methyl transferase (OphM) fused to the Omphalotin precursor peptide (OphA). In consequence, a ribosomal biosynthesis pathway involving the necessary and sufficient participation of the enzymes OphMA and OphP could be assumed. To further investigate this hypothesis, genes which are potentially involved in the biosynthetic pathway of Omphalotin were heterologously expressed in different host organisms. Particularly, Pichia pastoris could be identified as the most efficient expression system. Corresponding in vitro studies revealed that OphMA forms a homodimer which capable to self-methylate its C-terminal region consisting of the Omphalotin core sequence. The ability of self-methylation and the homodimeric mode of interaction could be confirmed via protein crystallization experiments. In heterologous co-expression studies of ophMA and ophP in Pichia pastoris, the production of Omphalotin could be observed and proven by detailed mass spectrometric analyses. Altogether, Omphalotin was proven to be the first ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide (RiPP) of fungal origin which could be autonomously produced in a heterologous expression system. Furthermore, it is so far the only known RiPP synthesized as a precursor peptide (OphA) translationally fused to its associated modification enzyme (OphM).
Das von dem Basidiomyceten Omphalotus olearius synthetisierte Undodecapeptid Omphalotin zeigt eine starke und selektive, nematizide Aktivität gegen den Pflanzenparasiten Meloidogyne incognita. In der Struktur zeigt das Peptid außergewöhnliche Modifikationen. Dabei sollen hier nur die neun Methylierungen an den α-Stickstoffatomen im Peptidrückgrat genannt werden. Auch wenn das Peptid seit nunmehr 30 Jahren entdeckt und dessen Struktur fast ebenso lange aufgeklärt ist, blieb der Biosynthesemechanismus bislang verborgen. In dieser Arbeit wurde die Biosynthese des pilzlichen Sekundärmetaboliten untersucht. Im Genom von O. olearius wurde ein Gencluster identifiziert, der potentiell für die Biosynthese von Omphalotin verantwortlich ist. Unter anderem beinhaltet dieser die Gene für eine Prolyl-Oligopeptidase (OphP) und das Fusionsprotein OphMA, bestehend aus einer Methyltransferase (OphM) und dem Vorläuferpeptid von Omphalotin (OphA). Daraus ergibt sich die Hypothese einer ribosomalen Biosynthese, bei der die Enzyme OphMA und OphP notwendig und hinreichend sind, um Omphalotin A zu produzieren. Die potentiell an der Biosynthese beteiligten Gene wurden heterolog in verschiedenen Wirtsorganismen exprimiert und die Hefe Pichia pastoris als effizientestes Expressionssystem gewählt. In in vitro Studien wurde gezeigt, dass OphMA als Homodimer interagiert und sich am eigenen C Terminus im Bereich der Omphalotin-Sequenz selbst methyliert. Durch die Kristallisation des Enzyms wurde ebenfalls die intermolekulare Selbst-Methylierung, sowie die Interaktion von OphMA als Dimer bestätigt. Im nächsten Schritt wurde ophMA mit ophP koexprimiert. Es wurde nachgewiesen, dass die entsprechenden Pichia-Zellen durch die parallele Synthese beider Enzyme Omphalotin A produzieren, wodurch die ursprüngliche Hypothese bestätigt wird. Damit ist Omphalotin das erste RiPP aus einem Pilz, das vollständig heterolog produziert werden konnte und weiterhin das einzige RiPP, dessen Vorläuferpeptid (OphA) zusammen mit seinem modifizierenden Enzym (OphM) transkribiert und translatiert wird.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/8736
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-7865
Exam Date: 24-Sep-2018
Issue Date: 2019
Date Available: 16-Apr-2019
DDC Class: 572 Biochemie
Subject(s): Omphalotin
Omphalotus olearius
Peptidantibiotika
RiPP
peptide antibiotics
License: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
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