Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-8099
Main Title: SEIRA optofluidics of sub-monolayers of biomolecules in nL-volumes
Translated Title: SEIRA Optofluidik an Submonolagen von Biomolekülen in nL-Volumen
Author(s): Kratz, Christoph Andreas
Advisor(s): Esser, Norbert
Referee(s): Esser, Norbert
Hinrichs, Karsten
Heberle, Joachim
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Optofluidics enables one to analyze minute amount of samples and facilitates new ways in the analysis of biological samples which are often only available in small amounts and should be used as economically as possible. The integration of in situ IR spectroscopy for the detection in optofluidics however is in a very early stage. In particular integration of SEIRA spectroscopy with metal island film substrates in optofluidics has not been reported yet. A flavor for the application potential of the technique is presented by a variety of performed studies with in situ IR and SEIRA spectroscopy of protein secondary structures and changes therein, protein aggregates, cells, (bio-) functional surfaces and ultrathin films. This thesis presents research and the invention of a novel concept of an optofluidic platform for in situ SEIRA spectroscopy, which illustrates that highly sensitive measurements in nL sample volumes with sub-monolayer sensitivity is feasible. The formations of self-assembled monolayers (SAMs) of the molecules 4-mercaptobenzonitrile and glutathione have been studied as model systems allowing one to determine adsorption kinetics. Sub-monolayer coverage down to a limit of detection of less than 15 ng/cm² can be monitored with a time resolution of minutes for a whole spectrum, corresponding to a limit of detection mass of only a few picograms of material in the detection area. The possibility to measure the dissociation/protonation of a 1.2 nm thick monolayer of glutathione in response to a change in the environmental pH could be shown for the steady-state as well as for the dynamics of the protonation process. The binding and the kinetics of the recognition of streptavidin on a biotinylated enhancement substrate was investigated as a model system for protein analysis. Experimental in situ SEIRA spectra showed that the vibrational signatures of amide I and amide II and changes thereof can be assessed during the adsorption process. These vibrational bands can be used to obtain information on the secondary structure of the protein and possible changes in the structure in response to the binding process. Different aspects concerning the employed enhancement substrates of metal island films have been investigated in the pursuit of the development of the optofluidic platform. Substrates with a gradient in gold film thickness have been utilized to study the correlation between morphology, enhancement and optical properties of different island films on a single substrate. Such substrates allow one to reduce the influences of substrate properties, pre-treatment, deposition and functionalization in the analysis of different morphologies. The possibility for an a priori quantification of the enhancement, independent of the molecule of interest, by analyzing the vibrational signature of the native oxide of the silicon substrate has been examined. The analysis indicated a correlation between the enhancement of the vibrational signature and the enhancement of the vibrational bands. Furthermore a novel route to obtain surface functionalization of enhancement substrates by the formation of hybrid substrates has been investigated, pairing functionalized graphene and gold island film substrates. The conservation of the enhancement properties of the substrate after the transfer process could be shown and the substrates were successfully applied in ex situ and in situ experiments. The results of this thesis illustrate the research possibilities of the novel developed concept for integrating in situ SEIRA spectroscopy in optofluidics. The obtained vibrational fingerprint of the molecules gives access to rich information which in combination with optical modeling and simulation will in the future enable one to investigate a myriad of different processes as protein-protein interaction, receptor-ligand binding or processes in lipid-membranes. The concept may also be of interest in the development of future structure sensitive sensing concepts, where in addition to the identification and quantification of a protein also its secondary structure can be analyzed.
Anwendungen im Bereich der Optofluidik ermöglichen durch die Integration optischer Messmethoden mit mikrofluidischen Komponenten das große Potential dieser Methoden für die Analyse kleinste Probenmengen im sub-μL-Bereich nutzbar zu machen. Dies ist insbesondere für die Analyse von biologischen Proben von hoher Relevanz, welche oft nur in kleinen Mengen verfügbar sind und so sparsam wie möglich eingesetzt werden sollten, und ermöglicht die Entwicklung neuartiger Ansätze und Methoden in diesem Bereich. Die Integration der in situ Infrarot (IR) Spektroskopie als Detektionstechnik in der Optofluidik fand hierbei auf Grund unterschiedlicher Herausforderungen in der Umsetzung solcher Konzepte bisher jedoch nur eine geringe Resonanz trotz der hohen Informationstiefe die diese Methode bieten könnte. Insbesondere der Einsatz von signalverstärkenden Konzepte wie der oberflächenverstärkten Infrarot (SEIRA) Spektroskopie mit Metall-Inselfilm-Substraten, welche hochempfindliche Messungen erlauben würden, wurde bisher nicht realisiert. Ein Eindruck des Anwendungspotentials der optofluidischen IR und SEIRA Spektroskopie für die Untersuchung der Sekundärstruktur von Proteinen und deren Änderung, Proteinaggregate, Zellen und der Eigenschaften von biofunktionale Oberflächen und ultra-dünnen Filmen kann aus einer Vielzahl von durchgeführten Studien an makroskopischen Flusszellen gewonnen werden. Diese Arbeit präsentiert das neuartige Konzept einer optofluidischen Plattform für die in situ SEIRA Spektroskopie mit der hochsensitive Messungen mit sub-monolagen Empfindlichkeit in nL Probenvolumen ermöglicht werden. Die selbstorganisierte Formierung von Monolagen und deren Kinetik wurde für die Modelmoleküle 4-Mercaptobenzonitril und Glutathion untersucht. Eine Empfindlichkeit für Sub-Monolagen-Bedeckungen der Oberfläche konnte auf einer Zeitskala von Minuten für die Aufnahme eines gesamten Spektrums bis zu einer Nachweisgrenze von 15 ng/cm² gezeigt werden. Diese Nachweisgrenze entspricht einer mit der Detektionsfläche gewichteten Nachweisgrenze von wenigen Picogramm des nachzuweisenden Moleküls. Die Möglichkeit die Dissoziation/Protonierung einer 1.2 nm dicken Monolage von Glutathion in Folge einer Veränderung des pH Wertes der Umgebung der Monolage zu messen, konnte sowohl im Gleichgewichtszustand als auch für die Dynamik der Protonierung gezeigt werden. Der Nachweis sowie eine Untersuchung der Anbindungskinetik von Streptavidin an eine Biotin-funktionalisierte Verstärkungsoberfläche diente als Modellsystem für die Analyse von Proteinen. Die gemessenen in situ SEIRA Spektren zeigten, dass die Schwingungssignatur der Amide I und Amide II Banden und Veränderungen derselbigen während des Adsorptionsprozesses detektiert werden können. Diese Vibrationsbanden können verwendet werden, um Informationen über die Sekundärstruktur des Proteins und mögliche Veränderungen dieser Struktur als Folge des Adsorptionsprozesses zu untersuchen. Für die Entwicklung der optofluidischen Plattform wurden unterschiedliche Eigenschaften der eingesetzten Metall-Inselfilm-Substrate, die als Verstärkungssubstrate verwendet wurden, untersucht. Substrate mit einem Gradienten in der Dicke des Goldfilmes wurden verwendet um die Korrelation zwischen der Morphologie, der Verstärkung und den optischen Eigenschaften verschiedener Inselfilme auf einem einzigen Substrate zu untersuchen. Solch ein Substrat erlaubt es hierbei die Einflüsse der Substrateigenschaften, der Vorbehandlung, der Deposition und der Funktionalisierung in der Untersuchung der unterschiedlichen Morphologie zu verringern. Die Möglichkeit einer a priori Quantifizierung der Verstärkung, unabhängig vom Zielmolekül, mittels der Analyse der Schwingungssignatur des nativen Oxids wurde untersucht. Hierbei konnte ein Anhaltspunkt für eine Korrelation zwischen der Verstärkung der Schwingungssignatur des nativen Oxids und der Verstärkung der Schwingungsbanden von organischen Molekülen gefunden werden. Des Weiteren wurde eine neue Möglichkeit der Oberfächenfunktionalisierung von Verstärkungssubstraten, durch die Formierung eines Hybridsubstrates durch den Transfer von funktionalisiertem Graphen auf Gold-Inselfilm-Substraten, untersucht. Hierbei konnte die Erhaltung der Verstärkungseigenschaften nach dem Transfer so wie die Anwendung in ex situ und in situ Experimenten gezeigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Möglichkeiten des entwickelten Konzeptes für die Integration der SEIRA Spektroskopie in der Optofluidik auf. Die gemessenen IR Spektren der Moleküle ermöglichen einen Zugang zu einer Vielzahl an Informationen, welche in Kombination mit optischen Modellen und Simulationen in der Zukunft die Möglichkeit eröffnen unterschiedlichen Prozessen wie Protein-Protein Wechselwirkungen, Rezeptor-Ligand Bindungen oder Prozesse in Lipid-Membranen zu untersuchen. Darüber hinaus kann das vorgestellte Konzept auch einen Beitrag in der Entwicklung zukünftiger Struktur-sensitiver Sensorkonzepten leisten, welche neben der Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen auch einen Zugang zu Informationen über die Sekundärstruktur bieten.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/8973
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-8099
Exam Date: 26-Nov-2018
Issue Date: 2019
Date Available: 11-Mar-2019
DDC Class: 530 Physik
Subject(s): surface enhanced infrared absorption
microfluidics
in situ infrared spectroscopy
plasmonic enhancement substrates
oberflächenverstärkte Infrarotabsorption
Mikrofluidik
In Situ Infrarot-Spektroskopie
plasmonische Verstärkungssubstrate
License: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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