Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-8142
Main Title: Model for tooth development in vitro
Translated Title: In vitro Modell der Zahnentwicklung
Author(s): Rosowski, Jennifer
Advisor(s): Lauster, Roland
Referee(s): Lauster, Roland
Rappsilber, Juri
Fleck, Claudia
Strietzel, Frank Peter
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: The ultimate goal of Tissue Engineering is the regeneration of whole organs or functional organ units. Recent approaches rely on the usage of adult tissue-specific cells in three-dimensional culture. It is now accepted that "Developmental Engineering", the recapitulation of critical initial steps of organogenesis in vitro, is more expedient. Identification of key players and basic mechanisms behind organ formation is one of the major challenges for tissue engineering. Developmental biology addresses these questions and much knowledge has been accumulated on the mechanisms behind organogenesis by studying animal models. However, animal models evince species-related limitations and arise ethical issues. Functional in vitro models emulating the physiological processes during human organ formation and homeostasis are requested and invaluable for future research. Here, a developmentally inspired approach is pursued to reproduce fundamental steps of human tooth organogenesis in vitro. The presented model comprises the usage of human dental pulp cells from adult donors that were expanded in monolayer before culture under non-adherent conditions to accomplish a 3D self-organized mesenchymal condensation. The cells reproducibly formed uniform organoids of 500 μm in diameter, resembling the size of a human mesenchymal tooth germ. Comprehensive gene expression analysis by qPCR and Next Generation Sequencing revealed a dramatic remodelling of the signalosome in the DPCs. The cells instantly responded to the changed culture conditions and subsequent cell-cell interaction with significantly modulated gene expression regarding cytoskeletal rearrangement. The suppression of RhoA activity was exhibited, a central molecule in actin-mediated mechanotransduction leading to cell shape change and subsequent induction of tissue-specific cell fate. The central role of actin-mediated signalling was evidenced by a functional assay, in which the actin polymerization and thereby cytoskeletal signalling was inhibited. No cell-cell contacts or condensation was observed in the DPCs upon administration of the inhibitor. Furthermore, central signalling pathways of mesenchymal condensation have been shown to be upregulated within the first six hours of the culture model. Among them are the TGFß- and Activin, the FGF, the Wnt, and the Notch pathway. The bivalent results from transcriptional analysis, regarding the activation status of the MAPK pathway, were unraveled by a MAPK reporter assay, which evidenced an immediate-early MAPK activity within minutes of condensation. A Collagen-binding eGFP-fused protein (CNA-eGFP) was applied to the DPC condensations to track Collagen protein secretion, which was visible after 4 hours. From protein analyses by immunohistological staining, after 4 days of condensation, the ECM components Tenascin, Fibronectin, Collagen type I and type IV were present in the DPC condensates. Long-term cultures of DPC condensates (4 weeks) showed odontogenic differentiation by upregulated expression of Dentin sialophosphoprotein, TGFß1, Activin, and BMP7. Inductive abilities of the self-organized dental mesenchyme were evidenced in co-culture with epithelial cells, that exhibited invagination and cytodifferentiation. The presented model of tooth development fulfills all demands on a functional human organogenesis model. It recapitulates the initial step of mesenchymal condensation and subsequent odontogenic differentiation and is capable of directing reciprocal differentiation induction of combined epithelium. Therefore, it represents a valuable model to study basic developmental mechanisms and is in the pipeline to find application in regenerative therapies.
Das Ziel des Tissue Engineering ist es, vollständige Organe oder funktionelle Organeinheiten in vitro herzustellen. Aktuelle Forschungsansätze beruhen auf der Verwendung adulter, gewebsspezifischer Zellen in drei-dimensionaler Zellkultur. Dabei wird die Rekapitulation initialer Schritte der Organogenese als vielversprechendste Herangehensweise betrachtet. Ein wesentlicher Aspekt des Tissue Engineering befasst sich daher mit der Identifizierung von zentralen Molekülen und den grundlegenden Mechanismen der Organentwicklung. Das Forschungsfeld der Entwicklungsbiologie hat unter Einsatz von Tiermodellen dahingehend viel zum aktuellen Wissensstand beigetragen. Diese bergen allerdings spezies-geschuldete Limitierungen und ethische Probleme. Funktionelle in vitro-Modelle, die die physiologischen Prozesse der humanen Organentwicklung und -aufrechterhaltung nachbilden, sind daher von unschätzbarem Wert für die zukünftige Wissenschaft. In der vorliegenden Arbeit wurde die Nachahmung der natürlichen Prozesse bei der initialen Zahnentwicklung im Menschen unter Kulturbedingungen erreicht. Das Kulturmodell basiert auf der Verwendung adulter in vitro-expandierter Zellen aus der Zahnpulpa (DPCs), die unter nicht-adhärenten Bedingungen mesenchymale Kondensation autonom vollziehen. Dabei formierten sich einheitliche Organoide von 500 µm Durchmesser, was der Größe eines humanen fetalen Zahnkeims entspricht. Umfassende Genexpressionsanalysen mittels qPCR und Next Generation Sequencing, offenbarten drastische Veränderungen im Signalosom der DPCs. Die Zellen antworteten auf die veränderten Kulturbedingungen und zahlreichen Zell-Zell-Kontakte mit einer signifikanten Regulation der Gene, die eine Rolle bei Remodellierung des Zytoskeletts spielen. Die RhoA-Aktivität wurde supprimiert, einem zentralen Molekül der Aktin-vermittelten Mechanotransduktion, das Veränderung der Zellform und die Induktion der gewebsspezifischen Zellidentität ermöglicht. Durch Inhibition der Aktinfilamentbildung, konnte die zentrale Rolle des Aktin-vermittelten Signalwegs in einem funktionellen Assay nachgewiesen werden. Die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten und die mesenchymale Kondensation wurde dabei komplett verhindert Zentrale Signaltransduktionswege der mesenchymalen Kondensation waren nach sechs Stunden der in vitro-Kondensation hochreguliert, unter anderem der TGFß-, der Activin-, der FGF-, der Wnt- und der Notch-Signalweg. Der aufgrund der RNA Seq Ergebnisse uneindeutige Aktivierungsstatus des MAPK-Signalwegs konnte in einem weiteren funktionellen Assay mithilfe eines Reportervektors geklärt werden. Innerhalb von Minuten wurde die MAPK-Aktivität unmittelbar als Reaktion auf die in vitro-Kondensation getriggert. Nach vierstündiger Kultur im Kondensationsmodell konnte die Kollagensekretion mittels eines Kollagen-bindenden-eGFP-Fusionsproteins in Echtzeit beobachtet werden. Weitere Proteinanalysen per Immunhistologie zeigten nach viertägiger Kultur die Anwesenheit der extrazellulären Moleküle TNC, FN, Collagen Typ I und IV. Die Genexpression von DSPP, TGFß1, Activin und BMP7 wiesen nach vierwöchiger Langzeitkultur auf eine odontogene Differenzierung innerhalb der Kondensate hin. Die Funktionalität im Hinblick auf Induktivität und reziproker Interaktion mit Epithelzellen, konnte in Co-Kulturansätzen gezeigt werden, wobei die epithelialen Zellen in das Mesenchym invaginiert sind und dort differenziert sind. Zusammengefasst kann in dieser Arbeit gezeigt werden, dass das angewandte Zellkulturmodell einem funktionellen humanen Organogenesemodell entspricht. Der initiale Schritt der mesenchymalen Kondensation und anschließende odontogene Differenzierung führen zur Bildung eines induktiven Zahnprimordiums, das mit epithelialen Zellen in Interaktion treten kann. An diesem Modell können zukünftige weitere Studien zur Aufklärung grundlegender Mechanismen der Organentwicklung stattfinden. Die produzierten Zahnkeime sollen in naher Zukunft Anwendung in Studien für regenerative Therapien finden.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de//handle/11303/9032
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-8142
Exam Date: 25-Jan-2019
Issue Date: 2019
Date Available: 13-Feb-2019
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): tissue engineering
dental pulp cells
mesenchymal condensation
organoid
human tooth development
dentale Pulpazellen
mesenchymale Kondensation
humane Zahnentwicklung
License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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