Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-8297
Main Title: Model-based strategies for scale-down studies in fed-batch cultivation of Escherichia coli expressing proinsulin
Translated Title: Modellbasierte Strategien für Scale-Down-Studien bei der Fed-Batch-Kultivierung von Escherichia coli
Author(s): Anane, Emmanuel
Advisor(s): Neubauer, Peter
Referee(s): Morbidelli, Massimo
Delvigne, Frank
Neubauer, Peter
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: A fundamental discrepancy in process performance (yields) exists between laboratory and industrial scale fermentation processes. This discrepancy results from heterogeneous environments in large-scale bioreactors due to the longer mixing times associated with the increasing volumes at industrial scale, compared to laboratory scale bioreactors. The effects of such process inhomogeneity or the so-called scale-up effects on microbial physiology and recombinant product quantity have attracted much attention in the bioprocess research community due to the negative impacts of the heterogeneities on process efficiency. In the past three decades, various forms of single compartment and multi-compartment scale-down bioreactors have been developed to study scale-up effects in fermentation processes. In the same period, there has been a phenomenal increase in the use of high throughput (HT) miniaturized bioreactor systems for strain screening and bioprocess development, which has significantly helped to reduce the times required for early bioprocess development. Yet another (unrelated) field of much progress within the same period is the use of mechanistic models for bioprocess development and control. These mathematical tools have greatly contributed to our understanding of the interactions between the organism and the constraints of growth in bioreactors, as well as the elucidation of otherwise obscure intracellular processes. However, these tools and concepts—scale-down bioreactors, HT minibioreactors and mathematical models have mainly developed in parallel, with little or no interaction among them. In effect, scale-down bioreactors are still operated as standalone, low throughput devices; and the benefits of mathematical models are not fully exploited in both scale-down and HT systems. In this work, we combine a mechanistic model with a parallel minibioreactor system to form a high throughput platform for studying the response of strains to scale-up effects at the screening phase. The mechanistic model is partly built on the operation mechanism of a two-compartment scale-down bioreactor and partly on advanced physiology of the expression system, Escherichia coli. During operation, the model is used to simulate the anticipated gradient profiles in large-scale bioreactors, and these are implemented in the minibioreactors using robotic liquid handling stations. As a demonstration, the platform was used to study the influence of glucose and dissolved oxygen gradients on both cell physiology and the misincorporation of non-canonical amino acids (ncBCAA) into recombinant proinsulin, in 24 parallel fed-batch cultivations of E. coli. The results show that in cultivations where the cells were subjected to model-derived glucose and dissolved oxygen gradients, there was a marked increase in the production of side metabolites, with reduced recombinant product formation rates and reduced yields. Additionally, the induced gradients resulted in more than 50-fold misincorporation of the ncBCAA norvaline into the recombinant proinsulin compared to the reference cultivation, which significantly undermines the product quality. The integration of the parallel minibioreactor system and mathematical tools provide an opportunity to perfom scale-down experiments in a high throughput manner. Therefore, screening of multiple strains can be combined with scale-down studies to select the most robust strains for bioprocess scale-up. Furthermore, HT cultivation in the developed platform can be used to generate large amounts of physiological data under defined stress conditions for advanced modelling and strain characterisation purposes.
Eine grundlegende Diskrepanz besteht in den Prozessausbeuten im Laborbioreaktor und in der industriellen Produktion. Diese resultieren aus längeren Mischzeiten mit steigenden Volumina, die in Großbioreaktoren Heterogenitäten bedingen, die so in Laborbioreaktoren nicht auftreten. Die Auswirkungen solcher Prozessinhomogenitäten auf die mikrobielle Physiologie sowie auf die Ausbeute und Qualität rekombinanter Proteine und anderer Produkte sind ein wichtiger Bestandteil der aktuellen Forschung. In den vergangenen Jahrzehnten wurden verschiedene Formen von ein- und mehrstufigen Scale-Down-Bioreaktoren entwickelt, um Scale-Up-Effekte in Fermentationsprozessen im Labor zu untersuchen. Gleichzeitig haben sich, mit dem Ziel einer schnelleren Bioprozessentwicklung, miniaturisierte parallelisierteBioreaktorsysteme für das Stammscreening und die Bioprozessentwicklung etabliert. Parallel zu den instrumentellen Entwicklungen wurden in den vergangenen Jahren mechanistische Modelle für die Entwicklung und Kontrolle von Bioprozessen verstärkt eingesetzt. Solche mathematischen Modelle können zu einem besseren Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Organismus und den Limitationen in Bioreaktoren sowie zur Aufklärung intrazellulärer Prozesse beitragen. Diese Werkzeuge und Konzepte - Scale-down-Bioreaktoren, HT-Minibioreaktoren und mathematische Modelle - haben sich jedoch bisher weitgehend parallel entwickelt. In vielen Fällen werden Scale-Down-Bioreaktoren als eigenständige Geräte mit geringem Durchsatz betrieben, und die Vorteile mathematischer Modelle werden sowohl in Scale-Down-Systemen als auch in HT-Systemen kaum genutzt. In dieser Arbeit wird ein mechanistisches Modell mit einem parallelen Minibioreaktorsystem zu einer Hochdurchsatzplattform für die Untersuchung von Stämmen auf Scale-up-Effekte in der Screening-Phase kombiniert. Das mechanistische Modell beschreibt die Funktion eines Zwei-Kompartment-Scale-Down-Bioreaktors und die Physiologie des zentralen Kohlenstoffmetabolismus von E. coli. Beim Screening wird das Modell verwendet, um die in großen Bioreaktoren erwarteten Gradientenprofile zu simulieren, die in den Minibioreaktoren über eine puls-basierte Medienzugabe mit robotergestützten Liquid Handling-Stationen umgesetzt werden. In der aktuellen Studie wurde die Plattform genutzt, um den Einfluss von Glukose- und Sauerstoffgradienten auf die Zellphysiologie und den Fehleinbau von nicht-kanonischen Aminosäuren zu untersuchen. Hierzu wurde Proinsulin als rekombinantes Modellprotein in 24 parallelen Kultivierungen mit dem Zulaufverfahren (Fed-batch) in E. coli produziert. Die Ergebnisse zeigen, dass in Kulturen, in denen die Zellen Glukose- bzw. Sauerstoff-Oszillationen ausgesetzt sind, die Produktion von Seitenmetaboliten wie z.B. Essigsäure deutlich zunimmt, und parallel die Produktbildungsrate sowie die finale Produktausbeute reduziert ist. Zusätzlich führt die puls-basierte Fütterung im Vergleich zur Referenzkultivierung zu einem 50-fach höheren Fehleinbau der nichtkanonischen Aminosäure Norvalin in das rekombinante Produkt. Die Integration des parallelen Minibioreaktorsystems und mathematischer Werkzeuge bieten die Möglichkeit, Scale-Down-Experimente mit hohem Durchsatz durchzuführen. Daher kann das Screening mehrerer Stämme mit Scale-down-Studien kombiniert werden, um robuste Stämme für das Scale-up auszuwählen. Darüber hinaus kann die entwickelte Plattform genutzt werden, um große Mengen an physiologischen Daten unter definierten Stressbedingungen für weiterführende und Stamm-Charakterisierungen zu generieren.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/9214
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-8297
Exam Date: 8-Mar-2019
Issue Date: 2019
Date Available: 9-May-2019
DDC Class: 620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten
Subject(s): modelling
scale-up effects
scale-down bioreactors
Escherichia coli
parallel minibioreactors
modellieren
Scale-up-Effekte
Scale-down-Bioreaktoren
parallele Minibioreaktoren
Sponsor/Funder: EC/H2020/643056/EU/Rapid Bioprocess Development/Biorapid
License: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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