Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-8309
Main Title: Spectroscopic investigation of phytochromes and NIR fluorescent variants
Translated Title: Spektroskopische Untersuchung von Phytochromen und NIR fluoreszierender Varianten
Author(s): Buhrke, David
Advisor(s): Hildebrandt, Peter
Referee(s): Hildebrandt, Peter
Bartl, Franz
Friedrich, Thomas
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Has Part: 10.14279/depositonce-8640
10.14279/depositonce-8214
Abstract: In this work, vibrational spectroscopic methods (resonance Raman [RR] and infrared absorption [IR]) were used for the investigation of phytochromes. Phytochromes are bistable photoreceptor proteins that bind bilins (BV, PCB, PΦB) as chromophores. Various plant, cyanobacterial, and bacterial variants regulate biological processes through the light dependent switching between metastable states that absorb red and far-red light (Pr and Pfr). The aim of the work was the elucidation of the mechanisms of photoinduced processes in different phytochromes. In the first part of the work, plant phytochromes were investigated. As in many (cyano-)bacterial variants, the Pr and Pfr states of plant phytochromes are not homogeneous, but instead exist as conformational equilibria of sub-states (I, II). As shown in this work, the distribution between Pfr-I and Pfr-II in plant phytochromes is affected i.a. by the N-terminal extension and binding of PIF proteins (phytochrome interaction factors), which in turn modulates the lifetime of the Pfr state. Furthermore, the photosensor constructs with and without the PHY domain (PAS-GAF-PHY [PGP], PAS-GAF [PG]) were analyzed in solution and in the crystalline state. While the respective Pr states have unaltered chromophore structures, PCB adopts a configuration similar to the Meta-Rc state in the photoproduct of the truncated PG variant. The investigations on cyanobacterial phytochromes in the second part of the work focused on the PCB-binding cyanobacteriochrome (CBCR) Slr-GAF3, which converts to a metastable green-absorbing (Pg) state after photoactivation of Pr. The unusual green absorption properties were analyzed on the basis of four different models proposed for the Pg state. A plausible explanation for the hypsochromic shift of the absorption bands is a twisted configuration of the pyrrole rings A and D in combination with a hydrated chromophore binding pocket. At low temperatures, Slr-GAF3 converts to an orange absorbing (Po) state. Various possible mechanisms of this transformation were discussed. The work on bacterial phytochromes (Bphs) in the third part of the dissertation comprises the decoding of thermal reaction mechanisms in the photocycle. For this purpose, a setup for time-resolved measurements was developed, which combines a flow-through system with a commercial FT-Raman spectrometer. Special features of the design are the continuous excitation in combination with a pre-resonant NIR measuring laser and the photochemical back-conversion of the sample in a reservoir. This is necessary to ensure that the dark-adapted state is the starting point for repetitive experiments. Using this technique, it was shown that the decay of the meta-states of the Bphs Agp1 and Agp2 not only leads to the formation of the active state, but also in an unproductive thermal shunt reaction back to the respective dark-adapted state. In the studies on the phytochrome-activated di-guanylyl cyclase IsPadC, the IR spectra suggest a reduced structural change of the PHY domain, which is essential for the formation of the activated (Pfr) state. These results confirm a Meta/Pfr heterodimer model, which was developed on the basis of time-resolved UV/vis data. In the fourth part of the thesis, the structural factors that influence the ratio of the different decay processes of the electronically excited state (Pr *) were investigated in order to allow the rational design of NIR-fluorescent Bphs (iRFPs). The Pr state of Bphs comprises a mixture of fluorescent (Pr-I) and non-fluorescent (Pr-II) substates that can be distinguished by RR spectroscopy. Therefore, the generation of highly fluorescent variants for fluorescence microscopy requires the shift of the conformational distribution towards Pr-I, as shown for iRFP713. The conformational equilibrium is affected by the substitution of amino acids both in the direct environment of the chromophore and at remote positions. Some iRFP variants with very high fluorescence quantum yields (FQY) contain a second cysteine in the GAF domain, which can also form a thioether bond to BV. Here, about 50% of the total protein ensemble contains the double-bound BV. It was shown in this work that the resulting internal crosslinking leads to a strong increase of FQY (16.6%) in iRFP682. RR spectroscopy indicates that the fluorescence gain, analogous to iRFP713, is due to an equilibrium shift towards Pr-I.
In dieser Arbeit wurden schwingungsspektroskopische Methoden (Resonanz-Raman [RR] und Infrarotabsorption [IR]) für die Untersuchung von Phytochromen verwendet. Phytochrome sind bi-stabile Photorezeptorproteine, die Biline (BV, PCB, PΦB) als Chromophore binden. Diverse pflanzliche, cyanobakterielle und bakterielle Varianten regulieren biologische Prozesse durch das lichtabhängige Schalten zwischen metastabilen Zuständen, die rotes und fern-rotes Licht absorbieren (Pr und Pfr). Ziel der Arbeit war die Aufklärung der Mechanismen photoinduzierter Prozesse in unterschiedlichen Phytochromen. Im ersten Teil der Arbeit wurden pflanzliche Phytochrome untersucht. Wie auch in vielen (cyano-)bakteriellen Varianten sind die Pr- und Pfr-Zustände pflanzlicher Phytochrome nicht homogen, sondern liegen jeweils als Konformationsgleichgewichte von Unterzuständen (I,II) vor. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, wird bei pflanzlichen Phytochromen die Verteilung zwischen Pfr-I und Pfr-II u.a. durch die N-terminale Verlängerung und die Bindung von PIF-Proteinen (Phytochrom-Interaktions-Faktoren) beeinflusst, was wiederum die Lebensdauer des Pfr-Zustands moduliert. Desweiteren wurden die Photosensorkonstrukte mit und ohne PHY-Domäne (PAS-GAF-PHY [PGP] und PAS-GAF [PG]) in Lösung und im kristallinen Zustand analysiert. Während die jeweiligen Pr-Zustände unveränderte Chromophorstrukturen aufweisen, nimmt PCB im Photoprodukt der verkürzten PG-Variante eine Konfiguration an, die dem Meta-Rc Zustand ähnelt. Die Untersuchungen an cyanobakteriellen Phytochromen im zweiten Teil der Arbeit konzentrieren sich auf das PCB-bindende Cyanobacteriochrom (CBCR) Slr-GAF3, welches nach Photo-aktivierung ausgehend von Pr in einen metastabilen grün absorbierenden (Pg) Zustand konvertiert. Die ungewöhnlichen grünen Absorptionseigenschaften wurden an Hand von vier verschiedenen Modellen analysiert, die für den Pg-Zustand vorgeschlagen wurden. Eine plausible Erklärung für die hypsochrome Verschiebung der Absorptionsbanden ist eine verdrehte Konfiguration der Pyrrolringe A und D in Kombination mit einer hydratisierten Chromophorbindungstasche. Bei tiefen Temperaturen wandelt sich Slr-GAF3 in einen orange-absorbierenden (Po) Zustand um. Verschiedene mögliche Mechanismen dieser Umwandlung wurden diskutiert. Die Arbeiten an bakteriellen Phytochromen (Bphs) im dritten Teil der Dissertation behandeln zum einen die Entschlüsselung der thermischen Reaktionsmechanismen des Photozyklus. Dazu wurde ein Aufbau für zeitaufgelöste Messungen entwickelt, der ein Durchflusssystem mit einem kommerziellen FT-Raman-Spektrometer kombiniert. Besonderheiten des Aufbaus sind die kontinuierliche Anregung in Kombination mit einem präresonanten NIR-Messlaser und der photochemischen Rückkonvertierung der Probe in einem Reservoir. Diese ist notwendig, um den dunkeladaptierten Zustand als Startpunkt für repetitive Experimente sicherzustellen. Mithilfe dieser Technik konnte gezeigt werden, dass der Zerfall der Meta-Zustände der Bphs Agp1 und Agp2 nicht ausschließlich zur Bildung des aktiven Zustands, sondern auch in einer unproduktiven Verzweigungsreaktion zurück zum jeweiligen dunkeladaptierten Zustand führt. Bei den Untersuchungen an der Phytochrom-aktivierten di-Guanylyl-Zyklase IsPadC lassen die IR Spektren auf eine reduzierte Strukturänderung der PHY-Domäne schließen, welche essentiell für die Bildung des aktivierten (Pfr) Zustands ist. Diese Ergebnisse bestätigen ein Meta/Pfr-Heterodimer-Modell, das auf der Grundlage zeitaufgelöster UV/Vis-Daten entwickelt wurde. Im vierten Teil der Arbeit wurde untersucht, welche strukturellen Faktoren das Verhältnis der verschiedenen Zerfallsprozesse des elektronisch angeregten Zustands (Pr*) beeinflussen, um das rationale Design NIR-fluoreszierender Bphs (iRFPs) zu ermöglichen. Der Pr-Zustand von Bphs umfasst eine Mischung von fluoreszierenden (Pr-I) und nicht-fluoreszierenden (Pr-II) Unterzuständen, die durch RR Spektroskopie unterschieden werden können. Die Erzeugung stark fluoreszenter Varianten für die Fluoreszenzmikroskopie erfordert daher die Verschiebung der Konformationsverteilung in Richtung Pr-I, wie für iRFP713 gezeigt wurde. Das Konformationsgleichgewicht wird durch die Substitution von Aminosäuren sowohl in der direkten Umgebung des Chromophors als auch an entfernten Positionen beeinflusst. Einige iRFP-Varianten mit sehr hohen Fluoreszenzquantenausbeuten (FQY) enthalten ein zweites Cystein in der GAF-Domäne, welches ebenfalls eine Thioetherbindung zu BV ausbilden kann. Hierbei liegen ca. 50% des gesamten Proteinensembles mit zweifach gebundenem BV vor. In dieser Arbeit wurde anhand von iRFP682 gezeigt, dass die resultierende interne Querverbindung zu einer starken Erhöhung der FQY (16,6%) führt. Mithilfe von RR Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass der Fluoreszenzgewinn, analog zu iRFP713, auf eine Gleichgewichtsverschiebung zu Pr-I zurückzuführen ist.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/9229
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-8309
Exam Date: 13-Mar-2019
Issue Date: 2019
Date Available: 31-May-2019
DDC Class: 541 Physikalische Chemie
Subject(s): phytochrome
resonance Raman spectroscopy
time-resolved spectroscopy
fluorescence spectroscopy
photoreceptors
Phytochrome
Resonanz-Raman-Spektroskopie
zeitaufgelöste Spektroskopie
Fluoreszenz-Spektroskopie
Fotorezeptoren
License: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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