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Main Title: Protokoll zur Viromanalyse bei Infektionen unklarer Genese
Translated Title: Protocol for virome analysis of infections of unknown origin
Author(s): Klenner, Jeanette
Advisor(s): Nitsche, Andreas
Referee(s): Nitsche, Andreas
Rappsilber, Juri
Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: de
Abstract: Next Generation Sequencing (NGS) eröffnete eine Vielzahl neuer Forschungsfelder in der Medizin und der Biologie. Der Einsatz von NGS-Technologien, wie z.B. der Metagenomik, reicht heute von der Grundlagenforschung bis hin zur angewandten Forschung. Allgemein wird davon ausgegangen, dass die Technologie des NGS schon in naher Zukunft in der klinischen Routinediagnostik eingesetzt werden wird. Metagenomik beschreibt dabei die Nukleinsäure-basierte Analyse gesamter Ökosysteme in einem ausgewählten Biotop bzw. in einer Probe. Dadurch besteht die Möglichkeit, die Gesamtheit aller in einer Probe enthaltenen Erreger, wie z.B. Viren oder Bakterien, zu identifizieren, ohne vorherige Kenntnisse über die enthaltenen Mikroorganismen zu haben. Metagenomanalysen werden zunehmend bei Untersuchungen von Infektionskrankheiten, Ausbruchsgeschehen oder bei neu auftretenden Krankheiten genutzt. Während die Technik des Sequenzierens selbst bereits sehr gut standardisiert ist, tragen zu einer erfolgreichen Diagnostik von Erregern in klinischen Proben zahlreiche weitere Schritte bei - besondere Bedeutung hat dabei die Probenvorbereitung. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines NGS-basierten Virusnachweissystems aus nicht- bis minimalinvasiv entnommenen klinischen Proben bei Infektionskrankheiten. Für die Etablierung wurden sechs Modellviren aus den Familien der Reo-, Pox-, Paramyxo-, Adeno-, Flavi- und Bunyaviridae, welche sich in ihrem Genom (RNA/DNA) und ihren Genomgrößen stark unterscheiden, in humanes Plasma gespiked. Mit Hilfe des hergestellten Vergleichsmaterials wurden verschiedene Aufreinigungsschritte und -protokolle verglichen und für ein bestmögliches Ergebnis miteinander kombiniert. Das endgültige Protokoll (FLUVID: fluid-based unbiased virus detection for viral metagenomics) wurde mittels des hergestellten Vergleichsmaterials und einer klinisch bestätigten HIV- (human immunodeficiency virus) positiven Blutprobe mittels real-time PCR und NGS auf deren Fähigkeit, Viren durch einen metagenomischen Ansatz zu detektieren, untersucht. Darauffolgend sollte bei Patienten (n=80) mit diagnostiziertem Fieber unbekannter Ursache (FUO) mittels des etablierten Protokolls eine mögliche gemeinsame oder individuelle virale infektiöse Ursache identifiziert werden. Die grundsätzlich am häufigsten vorkommenden Ursachen für FUOs sind Infektionskrankheiten, wie HIV (n=12), Hepatitis-B-Virus (n=7), Tuberkulose (n=6) sowie Malaria (n=2). Nach Nutzung des FLUVID-Protokolls konnten in dieser Arbeit individuelle virale Erreger identifiziert werden, dazu zählten GB-Virus-C, Hepatitis-E-Virus, Humanes Herpesvirus, Merkelzell-Polyomavirus, Torque-Teno-Virus und Alphatorque-Teno-virus. In der hier vorliegenden Arbeit konnte die Wahrscheinlichkeit, Viren in Metagenomstudien zu identifizieren, durch das entwickelte FLUVID-Protokoll erhöht werden. Darüber hinaus konnte die Übertragbarkeit des FLUVID-Protokolls auf klinische Proben gezeigt werden, weshalb sie zukünftig auch in der klinischen Diagnostik Anwendung finden könnten.
Next generation sequencing (NGS) opened a multitude number of new fields of research in medicine and biology. The application of NGS technologies, such as metagenomics, ranges from basic to applied research today. It is generally assumed that NGS will proceed to become a favorite tool in clinical routine diagnostics. Metagenomics describes the nucleic acid-based analysis of entire ecosystems in selected biotopes or samples, enabling the identification of all types of i.e. bacteria or viruses in samples without prior knowledge of the targets. Metagenomic sequencing is increasingly applied to investigate infectious diseases, disease outbreaks or newly emerging diseases. While the technique of sequencing itself is well established, numerous further steps are essential for successful diagnostic of pathogens in clinical samples, especially sample preparation. In this study, an NGS-based virus detection system from non-invasive to minimally invasive clinical samples in case of suspected infections was developed. Therefore, six model viruses (families of Reo-, Pox-, Paramyxo-, Adeno-, Flavi- und Bunyaviridae) with different genomes (RNA/DNA) and genome size were selected for the establishment and spiked into human plasma. The reference material was used to combine, modify and optimize various purification techniques and protocols, which were subsequently optimized and modified, compared and combined for the best result. The final protocols (FLUVID: fluid-based unbiased virus detection for viral metagenomics) were verified using the reference material and a representative HIV- (human immunodeficiency virus) positive clinical sample. Nucleic acid was analyzed by real time PCR and NGS on their capability aptitude to detect viruses by viral metagenome. Subsequently, using the established protocols a possible common or individual viral infectious cause in patients with diagnosed FUO (n=80) should be identified. Most common group of FUO was that of infectious diseases caused by viruses, bacteria or fungi. The most prevalent FUOs could be associated with infectious diseases such as HIV (n=12), hepatitis B virus (n=7), tuberculosis (n=6) or infections like malaria (n=2). After unbiased metagenomic sequencing of undiagnosed FUO patients - individual viral pathogens could be identified in this work by NGS, including HIV-1, GB virus C, hepatitis E virus, human herpesvirus, Merkel cell polyomavirus, torque teno virus und alphatorque teno virus. The likelihood of identifying viruses in metagenomic studies can be increased by applying the developed FLUVID protocols. In addition, the transferability of the FLUVID protocols to clinical samples has been demonstrated, why they can also be used in clinical diagnostics in the future.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/9524
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-8575
Exam Date: 23-May-2019
Issue Date: 2019
Date Available: 27-Jun-2019
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Viromanalyse
Metagenomik
NGS
FUO
Infektionen
virome analysis
metagenomic
infections
License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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