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Strategien zur HLA-Typisierung mit PyrosequencingTM
Strategien zur HLA-Typisierung mit PyrosequencingTM
Entz, Patricia
Inst. Biotechnologie
Der Haupthistokompatibilitätskomplex ist durch seine biologische Funktion eine für die Diagnostik und Forschung äußerst wichtige Region im humanen Genom. Die Untersuchung von HLA-Genorten stellt ein wichtiges Instrument in der molekulargenetischen Praxis dar. Die Pyrosequencing-Technik ist gut geeignet, um kurze DNA-Abschnitte mit weitgehend bekannter Sequenz schnell und effizient zu untersuchen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Pyrosequencing-basierten Methoden zur HLA-Typisierung. Exemplarisch wurden für drei wichtige HLA-Genorte, HLA-DQB1, HLA-DRB1 und HLA-B Untersuchungsstrategien entwickelt. Die Vorgehensweise wurde jeweils auf die Besonderheiten der unterschiedlichen Genorte angepasst. Die Strategien wurden an Standardproben validiert und in Kleinstudien angewendet. So wurde eine Fall-Kontroll-Studie zur Untersuchung einer möglichen Assoziation zwischen HLA-DRB1 und Alopecia areata mit Hilfe der entwickelten Typisierungsstrategie durchgeführt. Neben einer populationsgenetischen Untersuchung des HLA-B Genortes an Proben von Individuen aus Papua Neuguinea wurde die Pyrosequencing-Methode dafür eingesetzt, die Alleltrennung durch Haplotyp-spezifische Extraktion schnell und günstig zu überprüfen. Die Pyrosequencing Protokolle bieten eine sehr effiziente Alternative und Ergänzung zu den bestehenden HLA-Typisierungsmethoden.
Because of its biological function the mayor histocompatibility complex is an extremely interesting region in the human genome. The investigation of HLA gene loci is an important instrument in moleculargenetic praxis. The PyrosequencingTM technique is a fast and efficient method for the investigation of short DNA stretches with mostly known sequence. Goal of this work was to create a pyrosequencing-based method for HLA typing. For three different HLA-loci (HLA-DQB1, HLA-DRB1 and HLA-B) typing strategies were created. The proceedings were matched to the particularities of the different loci. The strategies were validated on standard samples and applied in small studies. A case-control-study on the possible association between HLA-DRB1 and alopecia areata was processed by means of the created typing strategy. A population genetic investigation of HLA-B on samples of individuals from Papua Newguinea was done. The method was applied for fast end convenient evaluation of allel separation after haplotyp specific extraction. The pyrosequencing-based protocols offer an efficient alternative and completition of the existing methods.
