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Analyses of hematopoiesis and lineage commitment from ES and iPS cells
Seiler, Katharina
Die Kultivierung embryonaler Stammzellen (ES Zellen) und ihre Differenzierung zu verschiedenen Arten hämatopoietischer Zellen in vitro wurde optimiert und standardisiert, um eine zeitlich definierte, quantitativ auswertbare zelluläre Entwicklung zu verfolgen.Diese standardisierten in vitro-Zellkultursysteme ermöglichten eine quantitative Analyse der Kapazitäten verschiedener ES- und iPS-Zelllinien, die sich durch die Anzahl der gebildeten erythroiden, lymphoiden und myeloiden Zellen bestimmen ließen. Es war erwartet worden, dass iPS-Zellen, die aus hämatopoietischen Knochenmarkzellen durch ektopische Expression von Sox-2, Oct-4 und Klf-4 generiert worden waren, aufgrund ihres epigenitischen Gedächtnisses in vitro effizienter in hämatopietische Zellen differenzieren als ES-Zellen. Erstaunlicherweise war die Effizienz der Differenzierung von iPS-Zellen im Vergleich zu ES-Zellen zu hämatopoietischen Zellen drastisch reduziert. Dabei wurde entdeckt, dass undifferenzierte als auch differenzierte iPS-Zellen höhere mRNA-Level der iPS-induzierenden Transkriptionsfaktoren Sox-2, Oct-4 und Klf-4 exprimierten als ES-Zellen. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieses standardisierte in vitro-Zellkultursystem dazu benutzt werden kann, langzeitig repopulierende hämatopoietische Vorläuferzellen aus ES-Zellen zu generieren. Die Entwicklung solcher hämatopoietischer Vorläuferzellen wurde durch Transplantation in sublethal-bestrahlte Rag2-/- γC-/--Rezipientenmäuse nachgewiesen. Die vom Donor abstammenden B- und T-lymphoiden und myeloiden Zellen wurden im Knochenmark, im Thymus, in der Milz und im Peritoneum selbst 4 Monate nach Transplantation mittels ihrer spezifischen genetischen Markergene und ihrer Differenzierungsantigene charakterisiert und quantifiziert. Transplantierbare hämatopoietische Vorläuferzellen in der Differenzierungskultur von ES-Zellen konnten nur in einem beschränkten Zeitfenster gefunden werden. Dies ist die erste Studie, in der eine langzeitige Repopulation immunodefizienter Mäuse mit unmodifizierten aus ES-Zellen entwickelten hämatopoietischen Vorläuferzellen gelungen ist. Retrovirale Transduktion von in vitro differenzierenden ES-Zellen mit dem chromatinremodellierenden HOXB4-Gen ermöglichte eine proliferative in vitro-Expansion der hämatopoietischen Vorläuferzellen. Deren Langzeit-Repopulationsvermögen in Knochenmarkstransplantations-ähnlichen Versuchen war nur 2- bis 10-fach geringer als die einer vergleichbaren Menge an normalen Knochenmarkszellen. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden Reporter-ES-Zelllinien generiert, die bacterial artificial chromosomes (BACs) tragen, welche YFP unter Kontrolle des preTα-Promotors und GFP unter Kontrolle des λ5-Promotors exprimieren. Die Analyse der in vitro-Differenzierung zu B- und T-lymphoiden Zellen zeigte, dass BAC λ5-GFP-transgene ES-Zellen das GFP-Markergen exprimieren, wenn sie zu preB-Zellen wurden, aber nicht, wenn sie sich zu preT/T-Zellen entwickelten. Im Gegensatz dazu exprimierten BAC preTα-YFP-transgene ES-Zellen YFP vom DN3-Stadium der T-Zellentwicklung an, wenn sie auf OP9-DL1-Stromazellen in Medium mit IL-7 und Flt-3L differenziert wurden. Dagegen blieben sie YFP-, wenn sie in B220+/CD19+ B-lymphoide Zellen auf OP9-Stomazellen in Medium mit IL-7 und Flt-3L differenziert wurden. BAC preTα-YFP-transgene Mäuse wurden durch pronukleäre Injektion des Reportergenkonstruktes erzeugt. Diese Mäuse wurden dann mit vorhandenen λ5-huCD25-transgenen Mäusen gekreuzt und deren Knochenmark und Thymus auf Reportergen-positive Zellen untersucht. Die einzelne Expression von YFP in den doppelt-transgenen Reportermäusen markiert Vorläuferzellen auf dem Weg zur T-Zell-, aber nicht zur B-Zellentwicklung, während huCD25 umgekehrt Zellen auf dem Weg zur B-Zellentwicklung charakterisieren. YFP+ huCD25+ doppelt-exprimierende Zellen wurden in Knochenmark und Thymus gefunden, aber können weder in Richtung B- noch in Richtung T-Zell-Potential proliferieren.
An in vitro culture system has been developed that allows to differentiate embryonic stem (ES) cells into different types of hematopoietic cell lineages. The standardised in vitro culture system allowed a quantitative assessment of the capacities of different ES and iPS cell lines developing to erythroid, myeloid and lymphoid cell lineages. It might have been expected that iPS cells generated from bone marrow-derived hematopoietic progenitor cells by ectopic expression of Sox-2, Oct-4 and Klf-4 would differentiate more efficiently than ES cells in vitro into hematopoietic cell lineages because of their epigenetic memory. Surprisingly, the efficiency to differentiate iPS cells to hematopoietic cells in vitro was found severely reduced compared to ES cells. In comparison to ES cells undifferentiated as well as differentiated stages of the iPS cell lines expressed elevated mRNA levels of the transcription factors Sox-2, Oct-4 and Klf-4 with which the iPS cells had been transduced. In the second part of this thesis it was shown that long-term repopulating hematopoietic progenitors could be generated from ES cells using the established in vitro culture system. The development of progenitors was assayed by transplantation into sublethally irradiated Rag2-/- γC-/- recipient mice. Donor-derived B- and T-lymphoid and myeloid lineage cells found in bone marrow, thymus, spleen and peritoneum were characterised and quantified 4 months after transplantation. Transplantable hematopoietic progenitors could be found in the differentiation culture of ES cells only in a limited time window. This is the first report showing long-term engraftment of immunodeficient mice with non-modified ES cell-derived hematopoietic progenitors. Retroviral transduction of differentiating ES cells with HOXB4 allowed proliferative in vitro expansion of hematopoietic progenitors. Their long-term repopulating capacities were only 2- to 10- fold lower than those of normal bone marrow cells. In the third part of this thesis reporter ES cell lines carrying bacterial artificial chromosomes (BACs) expressing YFP under the control of the preTα promoter and GFP under the control of the λ5 promotor have been generated. The analysis of in vitro differentiation into B and T lymphoid cells showed that the BAC λ5-GFP-transgenic ES cells became GFP+ when they developed into preB cells but not when they developed into preT/T cells. By contrast, BAC preTα-YFP-transgenic ES cells became YFP+ from the DN3 stage of T cell development on when they were differentiated on OP9-DL1 stromal cell in media containing IL-7 and Flt-3L, but stayed YFP- when developed into B220+/CD19+ cells on OP9 stromal cells in media containing IL-7 and Flt-3L. BAC preTα-YFP-transgenic mice were generated by pronuclear injection. They were crossed to existing λ5-huCD25 transgenic mice, and bone marrow and thymus were investigated for reporter gene-positive cells. Analysis of the double transgenic reporter mice showed that YFP marks T cell committed cells, while huCD25 marks B cell committed cells. YFP+ huCD25+ cells were found in the bone marrow and thymus but neither B nor T cell growth potential could be determined.
