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Das endodermale, hepatische Differenzierungspotenzial von adulten und embryonalen Stammzellen in vitro und in vivo
Wulf-Goldenberg, Annika
In der regenerativen Medizin besteht die Hoffnung, pluripotente embryonale und multipotente adulte Stammzellen für zellbasierte Therapien zu verwenden. Stammzellen, die in Hepatozyten differenzieren, können möglicherweise als Überbrückungstherapie extrakorporal im Bioreaktor oder durch intrahepatische Transplantation in Patienten mit akutem Leberversagen eingesetzt werden. Das Ziel der Arbeit war der Vergleich des endodermal hepatischen Differenzierungspotenzials von humanen pluripotenten, embryonalen Stammzellen und multipotenten, adulten CD34+ Stammzellen aus Nabelschnurblut unter identischen differenzierungsinduzierenden Bedingungen in vitro und in vivo. Mittels Gen- und Proteinexpression und zellulärer Strukturanalyse sollten essentielle Schritte der in vitro und in vivo Differenzierung identifiziert werden. Durch Zytokine, hepatisch konditioniertes AML12- und HepG2-Medium und Kokultur mit AML12-Hepatozyten wurde die hepatische Differenzierung in CD34+ Zellen und in humanen embryonalen Stammzellen in vitro geprüft. Die Ergebnisse der Experimente der endodermalen hepatischen Differenzierungsinduktion in vitro zeigten, dass der direkte Kontakt der adulten und embryonalen Stammzellen in Kokultur mit Hepatozyten einen Vorteil der Differenzierungsinduktion gegenüber dem konditionierten Medium bietet. In den humanen embryonalen Stammzellen der Linie SA002 konnte durch die in vitro Systeme eine endodermal hepatische Differenzierung induziert werden. Neben dem Anstieg der Expression von endodermalen Genen änderte sich auch die Morphologie der Zellen. Jedoch wurde keine eindeutige Differenzierung in funktionelle Hepatozyten erreicht. Die gewählten in vitro differenzierungsinduzierenden Bedingungen der konditionierten Medien und der Kokultur ermöglichten den CD34+ Zellen eine geringfügige Differenzierung in hepatisch endodermale Zellen. Die gewählten in vitro Bedingungen zeigten, dass der direkte Kontakt in der Kokultur die Differenzierung effizienter als die konditionierten Medien in den Stammzellen induzieren konnte. Es besteht jedoch der Bedarf, die bestehenden Differenzierungsprotokolle weiter zu verbessern. In immundefizienten Mäusen wurden unterschiedliche Leberschadensmodelle der Maus etabliert, um das Engraftment, die Organverteilung und das hepatische Differenzierungs- und Regenerationspotenzial von humanen Stammzellen nach in vivo Transplantation zu bestimmen. Die aus der Klinik abgeleiteten Leberschadensmodelle partielle Hepatektomie, chronischer Leberschaden durch Futterdiät und chemisch induzierter Leberschaden wurden erfolgreich in NOD/SCID Mäusen etabliert. Die erarbeiteten in vivo Modelle bildeten die Grundlage zur Prüfung des Regenerations- und Differenzierungspotenzials von undifferenzierten Stammzellen im Vergleich zu in vitro differenzierten Stammzellen. In Transplantationsversuchen erwiesen sich die Modelle von akuten Leberschäden in Verbindung mit verstärkenden Zytokinen wie den Hepatozytenwachstumsfaktor oder proliferationshemmenden Substanzen wie Monocrotalin für eine erfolgreiche Stammzelltransplantation als geeignet. Erst wenn die Stammzell-abgeleiteten Hepatozyten in präklinischen Modellen mit Leberschaden eine regenerative Wirkung zeigen und keine Nebenwirkungen hervorrufen, ist ein Einsatz in der regenerativen Medizin möglich. Vermutlich hat der Einsatz von hepatisch differenzierten Stammzellen als Leberersatztherapie noch einen längerfristigen zeitlichen Horizont.
There is hope for the clinical use of pluripotent embryonic and multipotent adult stem cells as cell-based therapies in regenerative medicine. Hepatocytes derived stem cells could be utilized extracorporal in bioreactors as bypass therapy, or through intrahepatic transplantation of patients with acute liver failure. The aim of the study was to compare the endodermal hepatic differentiation potential of human pluripotent embryonic stem cells with multipotent adult CD34+ stem cells derived from cord blood under identical differentiation induced conditions in vitro and in vivo. Crucial events of the endodermal differentiation process should be evaluated in vitro and in vivo by gene and protein expression, and cellular structural analysis. Cytokines, hepatic conditioned AML12 and HepG2 media and co-culture with AML12-hepatocytes were applied for studying the hepatic differentiation of CD34+ cells and of human embryonic stem cells in vitro. The results of the endodermal hepatic differentiation induction in vitro showed that the direct contact of the co-culture has advantages over the conditioned hepatic media for hepatic differentiation of stem cells. An endodermal hepatic differentiation was induced in human embryonic stem cells (line SA002) . The levels of gene expression of endodermal genes increased and the morphology of the cells changed. However, a well-defined differentiation into functional hepatocytes was not observed. The culture conditions slightly induced the differentiation of CD34+ cells into hepatic endodermal cells. In conclusion, the direct contact of adult and embryonic stem cells with hepatocytes in co-culture seems to have an advantage compared to the conditioned media by inducing different cell types. There is a need for further improving the existing differentiation protocols. Different liver injury models were established in immunodeficient mice for determining the engraftment, organ distribution and hepatic differentiation and regeneration potential of human stem cells after in vivo transplantation. Clinically derived liver injury models were induced in immunodeficient mice: acute chemical induced liver injury, chronic liver injury due to diet and acute liver injury due to partial hepatectomy. The liver injury models were chosen for determining the regenerative and differential potential of undifferentiated and differentiated stem cells in vivo. The established liver injury models of acute liver injury, chemically or surgically induced, seemed to be suitable for successful stem cell transplantation in combination with cumulative cytokines as HGF or proliferation inhibitor monocrotaline. The stem cell derived hepatocytes have to show a regenerative effect in preclinical models without side effects before they can be used in regenerative medicine. The application of hepatic differentiated stem cells for liver therapy seems to be achievable in the long-term.
