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Proteins are central functional components of life, yet studying their structure and interactions remains a major challenge. The work I present in this thesis aims at addressing this challenge, advancing the identification of crosslinked peptides by analysing their mass spectrometric fragmentation behaviour and leveraging the knowledge gained for the development of advanced acquisition methods.
First, I investigate the influence of the employed fragmentation method and parameters on peptides crosslinked with the most commonly used crosslinkers BS3 (bissulfosuccinimidyl suberate) and DSS (disuccinimidyl suberate). We show that the choice of fragmentation parameters greatly impacts the number of reliably identifiable crosslinks. The most significant factors impacting the crosslink identifications are fragment sequence coverage and acquisition speed. We developed a data-dependent decision tree acquisition method, choosing the best-performing parameters depending on analyte properties. We further established higher-energy C-trap dissociation (HCD) as the best overall single method for the analysis of BS3 / DSS crosslinked peptides.
Second, I present a web-based tool that enables the visualisation, sharing, and analysis of mass spectrometric fragment spectra. While the spectra identification process is nowadays dominated by database matching algorithms, visualisation for manual verification, hypothesis testing and (re-)analysis of identified spectra remain important. Our community-standard-compliant tool xiSPEC renders high-quality vector graphics of annotated spectra in the browser, allowing the readily testing of hypotheses and sharing of proteomics data. It is available as a stand-alone online service and has also been successfully integrated into other tools.
Third, I studied the fragmentation behaviour of linear peptides using ultraviolet photodissociation (UVPD), fragmenting analytes using a 213 nm UV laser. We analysed a wide variety of peptides using a specifically designed acquisition workflow and could show that the fragmentation behaviour of most linear peptides is relatively poor but improves with higher aromatic amino acid content. This work laid the foundation for the later development of a UVPD-cleavable crosslinker (UCCL).
Fourth, crosslinking MS was further advanced by introducing a cleavable moiety into the crosslinker reagent. This allowed for advanced acquisition regimes and showed promising results, especially for proteome-wide crosslinking. We analysed the fragmentation behaviour of the most commonly used CID-cleavable crosslinker disuccinimidyl disulfoxide (DSSO) showing that the major improvements result from improved sequence coverage by better fragmentation of the crosslinked peptides and less so from knowledge of the individual peptide masses. We further identified a lack of specificity and sensitivity in MS3-based approaches as a major hindrance to unlocking the full potential of MS-cleavable crosslinkers.
Fifth, the combination of insights gained from our UVPD fragmentation study with our work on CID-cleavable crosslinkers lead to the development of a UVPD-cleavable crosslinker. The mixed fragmentation of peptides and crosslinker inherent to CID-cleavable crosslinkers hampers the targeting of the individual peptides for separate fragmentation. Employing UVPD at 213 nm as an orthogonal fragmentation technique to specifically target a chromophore in the crosslinker largely increased the sensitivity and specificity of selecting individual peptides for MS3. The general concept of orthogonal cleavage between the linker and analyte presented could also improve the analysis of other linked analytes.
In summary, high-quality fragment spectra are crucial for the challenging analysis of crosslinked peptides, as they are the heart of the crosslink identification process. Advanced integrated workflows comprising functional crosslinkers, intelligent MS acquisition methods, and data analysis algorithms will continue to play a pivotal role in further enhancing crosslinking MS technology.
Proteine sind zentrale funktionelle Bestandteile des Lebens, doch die Erforschung ihrer Struktur und ihrer Interaktionen bleibt eine große Herausforderung. Die Arbeit, die ich in dieser Dissertation vorstelle, zielt darauf ab, diese Herausforderung anzugehen, die Identifizierung von quervernetzten Peptiden durch die Analyse ihres massenspektrometrischen Fragmentierungsverhaltens zu verbessern und die gewonnenen Erkenntnisse für die Entwicklung von weiterentwickelten Akquisitionsmethoden zu nutzen.
Zunächst untersuche ich den Einfluss der verwendeten Fragmentierungsmethode und -parameter auf Peptide, die mit den am häufigsten verwendeten Crosslinkern BS3 (Bissulfosuccinimidylsuberat) und DSS (Disuccinimidylsuberat) quervernetzt wurden. Wir zeigen, dass die Wahl der Fragmentierungsparameter einen großen Einfluss auf die Anzahl der zuverlässig identifizierbaren Quervernetzungen hat. Die wichtigsten Faktoren, die sich auf die Identifizierung von Quervernetzungen auswirken, sind die Fragmentsequenzabdeckung und die Akquisitionsgeschwindigkeit. Wir haben eine datenabhängige Entscheidungsbaum Akquisitionsmethode entwickelt, bei der die besten Parameter in Abhängigkeit von den Analyteigenschaften ausgewählt werden. Darüber hinaus haben wir die "higher-energy C-trap dissociation" (HCD) als die insgesamt beste Einzelmethode für die Analyse von BS3 / DSS-quervernetzten Peptiden ermittelt.
Zweitens stelle ich ein webbasiertes Tool vor, das die Visualisierung, das Teilen und die Analyse von massenspektrometrischen Fragmentspektren ermöglicht. Während der Prozess der Spektrenidentifizierung heutzutage von Datenbankabgleichsalgorithmen dominiert wird, bleibt die Visualisierung für die manuelle Verifizierung, das Testen von Hypothesen und die (erneute) Analyse der identifizierten Spektren wichtig. Unser Community-Standard-kompatibles Tool xiSPEC rendert hochauflösende Vektorgrafiken von annotierten Spektren im Browser und ermöglicht so das einfache Testen von Hypothesen und die gemeinsame Nutzung von Proteomikdaten. Es ist als eigenständiger Online-Dienst verfügbar und wurde außerdem erfolgreich in andere Tools integriert.
Drittens untersuchte ich das Fragmentierungsverhalten linearer Peptide mit der Ultraviolett-Photodissoziations-Fragmentierungsmethode (UVPD), bei der die Analyten mit einem 213-nm-UV-Laser fragmentiert werden. Wir analysierten eine Vielzahl von Peptiden unter Verwendung eines eigens konzipierten Akquisitionsverfahrens und konnten zeigen, dass das Fragmentierungsverhalten der meisten linearen Peptide mit dieser Technik relativ schlecht ist, sich aber mit einem höheren Gehalt an aromatischen Aminosäuren verbessert. Diese Arbeit legte den Grundstein für die spätere Entwicklung eines UVPD-spaltbaren Crosslinkers (UCCL).
Viertens, durch die Einführung einer spaltbaren Komponente in das Crosslinker-Reagenz wurde Crosslinking MS weiter vorangebracht. Dies ermöglichte fortgeschrittene Akquisitionsverfahren und zeigte vielversprechende Ergebnisse, insbesondere bei proteomweiten Crosslinking. Wir analysierten das Fragmentierungsverhalten des am häufigsten verwendeten CID-spaltbaren Crosslinkers Disuccinimidyldisulfoxid (DSSO) und zeigten, dass die wichtigsten Vorteile aus einer verbesserten Sequenzabdeckung durch eine bessere Fragmentierung der quervernetzten Peptide und weniger aus der Kenntnis der einzelnen Peptidmassen resultieren. Darüber hinaus haben wir einen Mangel an Spezifität und Empfindlichkeit bei MS3-basierten Ansätzen als Haupthindernis für die Ausschöpfung des vollen Potenzials von MS-spaltbaren Crosslinkern ermittelt.
Fünftens, die Kombination der Erkenntnisse aus unserer UVPD-Fragmentierungsstudie mit unserer Studie über CID-spaltbare Crosslinker führte zur Entwicklung eines UV-spaltbaren Crosslinkers. Die gemischte Fragmentierung von Peptiden und Crosslinker, die bei CID-spaltbare Crosslinker inhärent vorkommt, erschwert die Auswahl der einzelnen Peptide für eine separate Fragmentierung. Durch den Einsatz von UVPD bei 213 nm als orthogonale Fragmentierungsmethode, die spezifisch auf ein Chromophor im Crosslinker wirkt, konnte die Empfindlichkeit und Spezifität der Auswahl einzelner Peptide für MS3 erheblich gesteigert werden. Das vorgestellte allgemeine Konzept der orthogonalen Spaltung zwischen Linker und Analyt könnte auch die Analyse anderer gelinkter Analyten verbessern.
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass qualitativ hochwertige Fragmentspektren für die anspruchsvolle Analyse von quervernetzten Peptiden von entscheidender Bedeutung sind, da sie das Herzstück des Identifizierungsprozesses von Quervernetzungen darstellen. Fortschrittliche integrierte Workflows, die funktionelle Crosslinker, intelligente MS-Akquisitionsmethoden und Datenanalysealgorithmen umfassen, werden auch in Zukunft eine entscheidende Rolle bei der weiteren Verbesserung der Crosslinking-MS-Technologie spielen.
