In dieser Arbeit wurden die Resonanz-Raman-Spektroskopie (RR-Spektroskopie) sowie die oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Spektroskopie (SERR-Spektroskopie) verwendet, um biologische Systeme, insbesondere Hämproteine, zu untersuchen. Der elektronische Übergang der Hämgruppe kann ausgenutzt werden, um über gezielte Lichtanregung ausschließlich stark verstärkte Raman-Streusignale des Kofaktors zu erhalten. Adsorbiert an aufgerauten Silberelektroden kommt der Oberflächenverstärkungseffekt zum Tragen, der es ermöglicht, Proteine selbst bei Submonolagen-Beschichtung zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht die Elektrode die Ansteuerung von Oberflächenredoxreaktionen, was ausgenutzt werden kann, um Informationen über die Redox-Eigenschaften und Dynamik von Hämproteinen zu erhalten. Dieser experimentelle Ansatz wurde verwendet, um die Elektronentransferkinetik des Proteins Cytochrom c - ein kleines, redox-aktives Hämprotein in der mitochondrialen Atmungskette – zu untersuchen. Cytochrom c wurde dafür auf einer rauen Silberelektrode, beschichtet mit einer biomimetischen Monoschicht aus carboxyl-terminierten Alkanthiolen, immobilisiert und mit stationärer und zeitaufgelöster SERR-Spektroskopie untersucht. Besonderes Augenmerk wurde auf die Elektronentransfereigenschaften des Proteins bei kleinen Abständen zur Elektrode gelegt. Die Ergebnisse der Untersuchungen geben neue Aufschlüsse über den heterogenen Elektronentransfer und deuten dabei auf eine besondere Rolle des elektrischen Feldes an Grenzflächen hin. Dieses beeinflusst die Oberflächenorientierungsdynamik, die Elektronentunnel-Wahrscheinlichkeit und die Umstrukturierung der Wasserstoffbrückennetzwerke des Protein und an der Grenzfläche. Neben der Rolle als Elektronenüberträger in der Atmungskette fungiert Cytochrom c ebenso als Signalprotein in der Apoptose, dem programmierten Zelltod. Dafür muss es die mitochondriale Membran, an die es normalerweise gebunden ist, verlassen und ins Zellplasma übergehen. Die Ursache für diese Migration ist noch weitestgehend ungeklärt. Als ein Faktor, der den damit verbundenen Verlust an Redox- und die Zunahme an Peroxidase-Aktivität erklärt, wird die post-translationale Nitrierung von Tyrosinresten des Proteins diskutiert. Folglich wurde mittels RR-Spektroskopie der Einfluss von post-translationaler Tyrosin-Nitrierung auf die Integrität der Hämtasche untersucht. Es zeigte sich, dass die Destabilisierungen, hervorgerufen durch die Nitrierung verschiedener Tyrosinreste, nicht mit der jeweiligen gesteigerten Peroxidase-Aktivität korrelieren. Experimente, bei denen die verschiedenen Tyrosin-Mutanten auf eine Elektrode adsorbiert wurden, zeigten außerdem, dass die Grenzflächen bedingte Destabilisierung der Hämtasche unabhängig von der Nitrierung wirkt. Des Weiteren wurde die Anwendbarkeit der zeitaufgelösten SERR-Spektroskopie zur kinetischen Untersuchung von Biofilmen des Bakteriums Geobacter Sulfurreducens demonstriert. Dies ist möglich, da das Bakterium eine Reihe von Multihämproteinen, sogenannten "outer membrane cytochromes" (Omcs), besitzt, die für den extrazellulären Elektronentransfer verantwortlich sind. Besonders stark sind diese Cytochrome an der Grenzfläche zwischen Biofilm und Elektrode akkumuliert. Durch Anwendung von stationärer und zeitaufgelöster SERR-Spektroskopie konnte die besondere Rolle der Omcs als "Elektronenschleuse" zwischen Biofilm und Elektrode nachgewiesen und eine gemittelte heterogene Elektronentransferratenkonstante bestimmt werden. Weiter deuten die Experimente zusammen mit kinetischen Simulationen darauf hin, dass der heterogene Elektronentransfer der geschwindigkeitsbestimmende Schritt beim Elektronenaustausch Biofilm-Elektrode ist. Der letzte Teil der Arbeit ist der methodischen Entwicklung der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie zur Ausdehnung auf Nicht-Münzmetalle gewidmet. Dazu wurde eine Pt-Ag-Hybrid-Elektrode konstruiert, die aus einem nanoskopisch rauen Silberuntergrund, welcher zuerst mit einem dielektrischen Material beschichtet und anschließend mit einem Platinfilm überzogen wurde. Während der abgeschottete Silberuntergrund für die notwendige Oberflächenverstärkung sorgt, laufen an der Pt-Oberfläche die zu untersuchenden Grenzflächenreaktionen ab. Die Hybrid-Elektrode wurde in Bezug auf ihre Stabilität und ihre Signalverstärkungseigenschaften bei verschiedenen Wellenlängen untersucht. Die Resultate zeigen, dass starke Raman-Signale von Probenmolekülen, adsorbiert auf der äußeren Pt-Schicht, erhalten werden können. Die Signale sind nur geringfügig schwächer im Vergleich zu einer direkten Adsorption auf Ag.
In this thesis, resonance Raman (RR) and surface enhanced resonance Raman (SERR) spectroscopy were applied to investigate biological systems, articularly heme containing proteins. The electronic transition of the heme group can be exploited so that, with a properly tuned light excitation, highly intense Raman signals solely of the cofactor are obtained. If the proteins are adsorbed on a rough silver surface, then the resonance effect can be combined with the surface enhancement effect to yield a highly sensitive technique that allows probing of molecules even at sub-monolayer coverage. Additionally, if the surface is constituted by an electrode, surface redox reactions and kinetics of adsorbed molecules can be investigated. Such a setup was used to study the electron transfer (ET) properties of cytochrome c (cytc), a small soluble redox protein that acts as an electron shuttle in the respiratory chain. Cytc was immobilized on a rough silver electrode coated with a biomimetic monolayer of w-carboxylated alkanethiols and investigated by stationary and time resolved SERR spectroscopy. Specifically, the ET kinetics of the protein at short distances to the electrode was monitored. The results provide new insights into the heterogeneous protein ET and indicate a central role of the interfacial electric field, which has influence on the protein orientational dynamics as well as on the electronic coupling and the rearrangement of hydrogen bond networks at the protein-monolayer interface. Beside its function in bioenergetics, cytc also plays a key role as a signal transducer in the apoptosis, the programmed cell death. To exert this function, it has to be detached from the inner mitochondrial membrane, where it is bound to under normal conditions and released to the cytosol. The factors that control the transfer of cytc are still under debate. In this respect, a possible influence of posttranslational Tyr nitration to switch cytc’s function from ET to peroxidation, which is considered to be the first step in initiating apoptosis, is discussed. Therefore, mono-tyrosine and nitrated mono-tyrosine mutants were investigated using RR spectroscopy in order to evaluate the impact of tyrosine nitration on the integrity of the heme pocket. It could be shown that the destabilization caused by nitration is not directly correlated with the respective peroxidase activity of the mutant. Moreover, experiments in which the mutants were immobilized on a monolayer coated electrode showed that the destabilization, promoted by the interfacial electric field, did not depend on the nitration. Furthermore, the applicability of time resolved SERR spectroscopy for kinetic investigations of biofilms of the bacterium Geobacter Sulfurreducens, grown on rough silver electrodes, was demonstrated. The bacterium possesses a large number of multi-heme proteins, so-called outer membrane cytochromes (Omcs), which facilitate the extracellular ET. These cytochromes are accumulated at the biofilm-electrode interface and therefore can be probed using SERR spectroscopy. By applying stationary and time resolved SERR spectroscopy, it could be shown that these cytochromes function as electron ’gates’ between the biofilm and the electrode, and an average heterogeneous ET rate constant could be determined. Finally, results obtained from kinetic simulations indicate that the interfacial ET is the bottleneck of the biofilm-electrode ET process. The last part of the thesis is dedicated to methodological developments to expand the applicability of surface enhanced Raman (SER) spectroscopy to non-coinage metals. Here, a Pt-Ag device was fabricated, using a nanostructured Ag support that was coated by a dielectric layer and subsequently covered by a Pt island film. The idea is that the isolated underlying Ag support should provide the necessary surface enhancement, while the top metal layer promotes the interfacial reactions to be studied. The fabricated hybrid device was tested in terms of stability and SER performance.
