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Interactions and structures of the exopolysaccharide levan and β-lactoglobulin in binary and ternary systems
Hundschell, Christoph Simon
Exopolysaccharides are carbohydrate polymers produced by a variety of microorganisms. Depending on the microorganism and environmental conditions, they can differ in their monosaccharide structure, molecular weight and degree of branching. Despite this great diversity, only a few exopolysaccharides are used in a targeted manner in food products. An exopolysaccharide with great potential as a thickening, texturing and clouding agent is levan. In addition to these techno-functional properties, levan has health-promoting effects as a source of dietary fiber. This β-2,6-linked fructose polymer can be produced in situ by food-grade lactic acid and acetic acid bacteria. Moreover, its molecular weight and thus its functionality can be tailored by controlling the pH during fermentation. Despite the outstanding properties of levan, the macromolecular structure in dependence on the molecular weight has not yet been fully elucidated, and little is known about the behavior of levan in food-related protein-containing systems. A well-studied model protein for such systems with many applications in food products is β-lactoglobulin. It is a globular protein obtained from whey and has various functional properties such as gel formation or interfacial stabilization.
Therefore, this thesis investigates the fundamental mechanism of structure formation of levan in food-related protein-containing systems to establish levan as a functional polymer. For this purpose, the structures and interactions of levan, β-lactoglobulin and levan-β-lactoglobulin mixtures were systematically investigated on three levels (dilute – binary, dilute – ternary, concentrated – ternary). On the first level, the macromolecular structure and molecular interaction of the individual polymers in dilute systems were analyzed. It was shown that the macromolecular structure of levan shifted from a random coil to a compact spherical molecule with increasing molecular weight. Furthermore, a negative Mark-Houwink-Sakurada coefficient was found for the first time for biopolymers and could be attributed to an increase in molecular density with molecular weight. To determine the specific and non-specific interactions of β-lactoglobulin a new measurement protocol was established combining analytical ultracentrifugation and membrane osmometry. Specific molecular interactions were determined in terms of the dimer dissociation constant from analytical ultracentrifugation. The second virial coefficient corresponding to the non-specific interactions was measured by membrane osmometry and calculated considering the dimer dissociation. These measurements confirmed a strong contribution of electrostatic interactions on both kinds of interactions for β-lactoglobulin. On the second level, the molecular interactions and the phase behavior of dilute ternary levan-β-lactoglobulin mixtures were characterized. Repulsive pair interactions due to the excluded volume effect were found between levan and β-lactoglobulin. These were more pronounced for high molecular weight levan. In addition, it was shown that electrostatic interactions between the β-lactoglobulin molecules did not affect the pair interactions between levan and β-lactoglobulin but were decisive for the phase behavior of the mixtures. These results were confirmed on the third level, where the phase behavior and the gel network structure of concentrated ternary levan-β-lactoglobulin were analyzed. On the one hand, high molecular weights of levan and/or weak repulsive electrostatic interactions between the β lactoglobulin molecules caused the formation of phase-separated gels. On the other hand, strong repulsive electrostatic interactions combined with low molecular weights of levan favored the formation of swollen gels. In both cases, a strengthening of the gel network structure due to the local accumulation of β-lactoglobulin could be ascribed to the excluded volume effect. However, this effect was reversed when high levan concentrations sterically interfered with the gel formation of β-lactoglobulin.
Finally, this thesis contributes to a deeper understanding of levan in food-relevant, protein-rich systems. In general, interactions between levan and β-lactoglobulin are dominated by the excluded volume effect. These observations can be generalized for globular proteins and enable the understanding of structure-function relationships in various levan-containing food systems.
Exopolysaccharide sind hochmolekulare Kohlenhydrate, die von einer Vielzahl an Mikroorganismen produziert werden. In Abhängigkeit der Art des Mikroorganismus und der Milieubedingungen können sie sich in ihrer Monosaccharidstruktur, ihrem Molekulargewicht und der Anzahl an Seitenketten unterscheiden. Trotz der großen Vielfalt an Exopolysacchariden werden nur wenige dieser Polymere gezielt in Lebensmitteln eingesetzt. Ein Exopolysaccharid mit großem Potential als Verdickungsmittel, Strukturbildner und Trübungsmittel ist Levan. Neben den genannten technofunktionellen Eigenschaften weist es als Ballaststoff auch eine gesundheitsfördernde Wirkung auf. Zudem ist es möglich, dieses β-2,6-verknüpfte Fruktosepolymer von Milchsäure- und Essigsäurebakterien in situ in Lebensmitteln zu produzieren. Darüber hinaus kann das Molekulargewicht von Levan und damit seine Funktionalität durch die Kontrolle des pH-Werts während der Fermentierung angepasst werden. Trotz dieser herausragenden Eigenschaften ist die makromolekulare Struktur von Levan in Abhängigkeit des Molekulargewichts noch nicht vollständig aufgeklärt. Zudem ist nur wenig über die Eigenschaften von Levan in lebensmittelrelevanten proteinhaltigen Systemen bekannt. Ein bestens charakterisiertes Modelprotein für diese Systeme mit zahlreichen Anwendungen in der Lebensmittelindustrie ist β-Lactoglobulin. Dieses globuläre Protein wird aus Molke gewonnen und hat zahlreiche technofunktionelle Eigenschaften, wie die Ausbildung von Gelnetzwerken oder die Stabilisierung von Grenzflächen.
Um Levan als funktionelles Polymer zu etablieren, wird in dieser Arbeit der grundlegende Mechanismus der Strukturbildung von Levan in lebensmittelrelevanten proteinhaltigen Systemen untersucht. Hierzu wurden die Strukturen und Interaktionen von Levan, β-Lactoglobulin und Levan-β-Lactoglobulin Mischungen systematisch auf drei Ebenen (verdünnt – binär, verdünnt – tenär, konzentriert – tenär) untersucht. Auf der ersten Ebene wurde die makromolekulare Struktur und die molekularen Interaktionen der einzelnen Polymere in verdünnten Systemen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die makromolekulare Struktur von Levan mit zunehmenden Molekulargewicht von einer Random Coil Struktur zu einer kompakten sphärischen Struktur übergeht. Darüber hinaus konnte für Levan als erstes Biopolymer ein negativer Mark-Houwink-Sakurada Koeffizient gefunden werden. Dies konnte auf eine Zunahme der Moleküldichte mit zunehmendem Molekulargewicht zurückgeführt werden. Zur Bestimmung der spezifischen und unspezifischen Wechselwirkungen von β-Lactoglobulin wurden analytische Ultrazentrifugation und Membranosmometrie in einer neuen Methode kombiniert. Spezifische molekulare Wechselwirkungen wurden anhand der Dimer-Dissoziationskonstante aus der analytischen Ultrazentrifugation analysiert. Als Maß für unspezifische Wechselwirkungen wurde der zweite Virialkoeffizient unter Berücksichtigung der Dimer-Dissoziation mittels Membranosmometrie bestimmt. Diese Messungen bestätigten einen starken Beitrag der elektrostatischen Wechselwirkungen zu den spezifischen und unspezifischen Wechselwirkungen von β-Lactoglobulin. Auf der zweiten Ebene wurden die molekularen Wechselwirkungen und das Phasenverhalten von Levan-β-Lactoglobulin Mischungen in verdünnten ternären Systemen charakterisiert. Hierbei konnten repulsive Paar Interaktionen zwischen beiden Polymerspezies auf den Excluded Volumen Effekt zurückgeführt werden. Diese Interaktionen waren für hochmolekulares Levan stärker ausgeprägt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass elektrostatische Wechselwirkungen zwischen β-Lactoglobulin Molekülen die Paar Interaktionen zwischen Levan und β-Lactoglobulin nicht beeinflussten. Allerdings waren diese für das Phasenverhalten der Mischungen entscheidend. Diese Ergebnisse konnten durch die Analyse des Phasenverhaltens und der Gel-Netzwerkstruktur von konzentrierten ternären Levan-β-Lactoglobulin Mischungen bestätigt werden. Die Ausbildung von phasenseparierten Gelen wurde durch ein hohes Molekulargewicht des Levans sowie durch geringe repulsive elektrostatische Interaktionen zwischen den β-Lactoglobulin Molekülen begünstigt. Gequollene Netzwerke konnten im Fall eines niedrigen Molekulargewichts des Levans in Kombination mit stark abstoßenden elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den Proteinen beobachtet werden. In beiden Fällen wurde die Gel-Netzwerkstruktur durch die lokale Aufkonzentrierung von β-Lactoglobulin aufgrund des Excluded Volume Effekts verstärkt. Allerdings führte eine zu hohe Levankonzentration aufgrund sterischer Effekte zur Behinderung der Gel-Netzwerkbildung des β-Lactoglobulin.
Letztendlich trägt diese Arbeit zu einem tieferen Verständnis von Levan in lebensmittelrelevanten, proteinreichen Systemen bei. Mischungen aus Levan und β-Lactoglobulin werden hauptsächlich durch den Excluded Volume Effekt dominiert. Diese Ergebnisse können auf andere globuläre Proteine übertragen werden und ermöglichen so ein tieferes Verständnis der Struktur-Funktions-Zusammenhänge von Levan in Lebensmittel-systemen.
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