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Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden durch den retinalen Photorezeptor Opsin
Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden durch den retinalen Photorezeptor Opsin
Piechnick, Ronny
Inst. Biotechnologie
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Gruppe der Zelloberflächenrezeptoren in Vertebraten. Rhodopsin ist der am besten untersuchte GPCR und diente lange als Vorlage für das Verständnis anderer GPCRs. Rhodopsin besteht aus dem Apoprotein Opsin und dem inversen Agonisten 11-cis-Retinal, der über eine Schiff’sche Base kovalente mit der Lys296-Seitenkette des Opsins verknüpft ist. Die lichtinduzierte Isomerisierung des 11-cis-Retinals zum Agonisten all-trans-Retinal führt zur Aktivierung des Rhodopsins. Nach der Entstehung der aktiven Konformation (Meta II) wird die Schiff’sche Base zwischen all-trans-Retinal und Opsin hydrolysiert und all-trans-Retinal verlässt das Protein. Anschließend kann 11-cis-Retinal aufgenommen werden, wodurch sich wiederum Rhodopsin bildet. Um die zugrunde liegenden Mechanismen der Rhodopsinregeneration und des Meta II-Zerfalls besser zu verstehen, wurde in dieser Arbeit die Interaktion von Opsin mit seinen Retinalliganden untersucht. Ein Teil dieser Arbeit beschreibt die Aufnahme und Abgabe des Retinals durch Opsin. Die Kristallstrukturen des Meta II und aktiven Opsins ließen zwei Öffnungen eines mutmaßlichen Ligandenkanals erkennen, der die Retinalbindungstasche mit der hydrophoben Membranumgebung verbindet. Die Existenz dieses Kanals und die Rolle der zwei Öffnungen bei der Aufnahme und Abgabe des Retinals wurden durch die ortsgerichtete Mutagenese experimentell überprüft. Die Ergebnisse zusammengenommen zeigten, dass die Mutationen nicht lokal auf die Kanaldurchlässigkeit wirken, sondern weitreichende Effekte auf die Struktur des gesamten Rezeptors haben. In dieser Arbeit wurde ein Modell für die Rezeptor-Retinal-Interaktion entwickelt, in dem die aktive Rezeptorkonformation (Opsin*) für das Öffnen des Retinalkanals notwendig ist. Darüber hinaus kann gesagt werden, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Bildung des Rhodopsins oder beim Zerfall des Meta II die richtige Positionierung des Liganden innerhalb der Bindungstasche am Lys296 ist. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschreibt die Rolle des Opsin* bei der Retinalaufnahme. Die Bindung des C-terminalen Endes des Gtα-Proteins führt zur Verschiebung des Opsin/Opsin*-Gleichgewichts und stabilisiert Opsin*. Die Untersuchungen zeigten, dass die Opsin*-Konformation all-trans-Retinal reversibel aufnehmen und es über eine Schiff’sche Base kovalent an Lys296 binden kann. Basierend auf diesen Untersuchungen kann Opsin auch als ein Rezeptor für diffusionsfähige Liganden aufgefasst werden. Ein letzter Teil dieser Arbeit beschreibt die Untersuchung der Hydrolyse der Schiff’schen Base durch die Verwendung von Hydroxylamin (HA) und seinen Derivaten. Die Ergebnisse zeigten, dass HA den Zerfall der lichtaktivierten Metarhodopsinspezies beschleunigte, während größere Derivate keinen signifikanten Einfluss hatten. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass ein Wasserkanal existiert, der sich nach der Lichtaktivierung des Rhodopsins öffnet und extrem stringent in Bezug auf die Größe und Polarität der einströmenden Substanzen ist. Zusammenfassend demonstrieren diese Ergebnisse, dass die aktive Konformation des Rezeptors eine zentrale Rolle bei der Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden spielt. Während die Hydrolyse und Abgabe des all-trans-Retinals durch die aktive Rezeptorkonformation induziert wird, folgt die Aufnahme des 11-cis und all-trans-Retinals verschiedenen Mechanismen. Diese Arbeit gibt Aufschluss über die komplexen kinetischen und strukturellen Mechanismen, die den Aufnahme- und Abgabeprozess des Retinalliganden steuern.
G protein-coupled receptors (GPCRs) are one of the largest groups of cell surface receptors in vertebrates. Rhodopsin is the best investigated GPCR and has long stood as a model for understanding other GPCRs. Rhodopsin consists of the apoprotein opsin and the inverse agonist 11-cis-retinal, which is Schiff base-linked to residue Lys296. Light-induced isomerisation of 11-cis-retinal to the agonist all-trans-retinal leads to activation of rhodopsin. After formation of the active conformation (Meta II), the retinylidene Schiff base is hydrolysed and all-trans-retinal is released from opsin. 11-cis-retinal is then taken up, which reforms rhodopsin. In this thesis the interaction of opsin with its retinal ligands was investigated to better understand the underlying mechanisms of rhodopsin regeneration and Meta II decay. A first part of this thesis explores the uptake and release of retinal from opsin. The crystal structures of Meta II and active opsin revealed two openings of a presumable ligand channel which connects the retinal binding pocket with the hydrophobic membrane environment. The existence of this ligand channel and the role of the openings in the uptake and release of retinal were experimentally tested by site-directed mutagenesis. Overall the results showed that the mutations did not have local effects on channel permeability, but rather had long ranging effects on the entire receptor structure. This study developed a model of receptor-ligand interactions, in which the active receptor conformation (Opsin*) is necessary for the retinal channel to be open. Furthermore, the rate limiting step for either the formation of rhodopsin or Meta II decay is the correct positioning of ligand within the binding pocket relative to Lys296. In a second presented part of this thesis, the role of Opsin* in retinal uptake was further explored. Binding of the c-terminal end of Gtα protein was found to stabilize Opsin* relative to inactive opsin. Opsin* was observed to take up all-trans-retinal and form a retinylidene Schiff base with Lys296. Based on these observations, opsin can be understood as a receptor for diffusible ligands. In a final presented part of this thesis, retinal Schiff base hydrolysis was investigated using hydroxylamine (HA) and its alkylated derivatives. Briefly, HA accelerated the decay of light-activated metarhodopsin species, while the larger derivatives had little influence. The results imply the existence of a water channel,which is opened in light-activated rhodopsin and is extremely stringent with regard to size and polarity of inflowing substances. In summary, these results demonstrate that the active conformation of the receptor plays a central role in the uptake and release of retinal. While the hydrolysis and release of all-trans-retinal is induced by the active receptor conformation, the uptake of 11-cis- and all-trans-retinal follows different mechanisms. The work presented in this thesis sheds light on the complex kinetic and structural mechanisms governing the uptake and release process of the retinal ligand.
