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Investigation of hydroxy acid utilization in fungal nonribosomal cyclodepsipeptide synthetases
Hoffmann, Sylvester
The fungal oligomeric cyclodepsipeptides (CDPs) are formally constructed from dipeptidol monomers, which contain an α-D-hydroxy acid and a N-methylated α-L-amino acid and are biosynthesized by iterative nonribosomal peptide synthetases (NRPSs). Examples for these peptides are bassianolide, beauvericin, the enniatins and PF1022 derivatives. Various promising bioactivities comprising anthelminthic, antibiotic, and antifungal properties as well as their partial pharmaceutical applications lead to numerous studies aiming to increase the overall yield or change the chemical composition of these compounds. The latter was realized by chemoenzymatics, precursor directed and combinatorial biosynthesis as well as mutasynthesis.
Despite these extensive studies, important aspects of the biosynthesis remain unknown as of today. For instance, it is known that the first module of the NRPS incorporates the α-D-hydroxy acid into the corresponding CDP, yet the mechanism behind the activation in the respective adenylation (A) domain could not be clarified. There is also an important difference between the incorporation of α-hydroxy acids in fungal and bacterial NRPS systems: Fungal systems directly activate and incorporate a previously biosynthesized α-hydroxy acid into the nonribosomal peptide (NRP). However, in bacterial systems an α-keto acid is activated first and then reduced to the corresponding α-hydroxy acid by a downstream ketoreductase domain. Crystal structures of such a depsipeptide module and the associated A domain were recently published and were able to explain the stabilization of the substrate within the active site. Furthermore, a crystal structure of an engineered bacterial A domain was published that catalyses the activation of L-phenyl lactate. A binding mechanism for α-hydroxy acids was postulated based on this structure, which relies on the formation of hydrogen bonds of the substrate´s hydroxy group towards a carbonyl group of the peptide backbone and a hydrogen bond donor (Cys, Ser, Thr) in the substrate binding pocket. However, further studies for a final confirmation are necessary as the substrate was not resolved in the crystal structure. Clarification of the conversion of α-D-hydroxy acids in fungal NRPS systems would lead the way for a targeted exchange of building blocks within NRPs and therefore contribute to the specific biosynthesis of new depsipeptides by modulation of the A domains.
To shed light on this unsolved mechanism constructs of fungal A domains that facilitate conversion of the α-D-hydroxy acid D-hydroxyisovaleric acid (D-Hiv) were designed and the solubility of the respective proteins was assayed. Soluble proteins were heterologously expressed in large scale in E. coli and a purification protocol was established. Proteins were obtained in high purity and were further characterized by LC-MS/MS und circular dichroism spectroscopy. Activities and enzyme kinetic parameters of the A domain constructs were determined by a continuous photometric hydroxylamine release assay. Crystallization trials of characterized proteins were executed to generate a high-resolution X-ray structure. None of the tested conditions yielded protein crystals so far.
Alternatively, a homology model of the A domain was created and the substrate D-Hiv was modelled into the substrate binding pocket by molecular docking. Site-directed mutagenesis of the active site was used to gather information concerning substrate binding which was in accordance with the molecular docking model. We also attempted to engineer the A domain towards activation of amino acids (AA) to further increase the knowledge of the substrate activation mechanism and to lay the foundation for further engineering of the fungal NRPSs.
Die fungalen oligomeren Zyklodepsipeptide Bassianolid, Beauvericin, die Enniatine und PF1022-Derivate werden formal aus Dipeptidolen, welche aus einer α-D-Hydroxysäure und einer N-methylierten α-L-Aminosäure bestehen, aufgebaut und von iterativen nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPSs) hergestellt. Aufgrund der Vielzahl von interessanten Bioaktivitäten wie z. B. der anthelmintischen, antibiotischen und antifungalen Eigenschaften und der teilweise pharmazeutischen Anwendung wurden zahlreiche Studien unternommen die Ausbeuten zu erhöhen oder die chemische Zusammensetzung dieser Komponenten durch Methoden wie chemoenzymatischer, Vorläufer-dirigierter, oder kombinatorischer Biosynthese sowie Mutasynthese zu beeinflussen.
Trotz dieser umfangreichen Studien sind wichtige Aspekte der Biosynthese nach wie vor ungeklärt. So ist beispielsweise bekannt, dass das erste Modul der NRPSs den Einbau der α-D-Hydroxysäuren in das entsprechende Zyklodepsipeptid ermöglicht. Der Mechanismus der Aktivierung in der entsprechenden Adenylierungsdomäne (A-Domäne) ist hingegen unbekannt. Die Verwendung von α-Hydroxysäuren in fungalen und bakteriellen NRPS-Systemen weist außerdem einen entscheidenden Unterschied auf: Fungale Systeme aktivieren eine zuvor biosynthetisierte α-Hydroxysäure und bauen diese direkt in das nicht-ribosomale Peptid ein. In bakteriellen Systemen hingegen wird zunächst eine α-Ketosäure aktiviert und anschließend durch eine Ketoreduktase-Domäne zur α-Hydroxysäure reduziert. Die Kristallstrukturen eines solchen bakteriellen Depsipeptidmoduls und der dazugehörigen A-Domäne wurden vor kurzem veröffentlicht, hierbei konnte auch die Stabilisierung des Substrats im aktiven Zentrum aufgeklärt werden. Weiterhin wurde die Kristallstruktur einer umprogrammierten bakteriellen A-Domäne publiziert, welche die Aktivierung von L-Phenyllactat katalysiert. Auf Grundlage dieser Struktur wurde ein Bindungsmechanismus für α-Hydroxysäuren postuliert, welcher auf der Ausbildung von Wasserstoffbrücken der Hydroxy-Gruppe des Substrates zu einer Carbonyl-Gruppe des Peptidrückgrats und einem Wasserstoffbrücken-Donor (Cys, Ser, Thr) innerhalb der Substratbindungstasche beruht. Da das Substrat in dieser Struktur fehlt, sind jedoch weitere Studien zur endgültigen Bestätigung notwendig. Die Aufklärung der Umsetzung von α-D-Hydroxysäuren in den pilzlichen NRPS-Systemen könnte den gezielten Austausch der Bausteine in nicht-ribosomalen Peptiden ermöglichen und somit zur zielgerichteten Biosynthese neuer Depsipeptide durch Modulierung der A-Domänen beitragen.
Im Zuge dieser Arbeit wurden daher Konstrukte der fungalen A-Domänen, welche die α-D-Hydroxysäure D-Hydroxyisovaleriansäure (D-Hiv) konvertieren, erstellt und Löslichkeitsstudien der entsprechenden Proteine durchgeführt. Lösliche Proteine wurden im großen Maßstab heterolog in E. coli exprimiert und ein Aufreinigungsprotokoll etabliert. Die Proteine konnten in hoher Reinheit gewonnen werden und wurden weiterhin durch LC-MS/MS und Circulardichroismus-Spektroskopie charakterisiert. Die Aktivität der A-Domänen und die enzymkinetischen Parameter wurden mit einem kontinuierlichen photometrischen Hydroxylamin-Freisetzungs-Assay bestimmt. Vollständig charakterisierte Proteinkonstrukte wurden schließlich Kristallisationsversuchen unterzogen mit dem Ziel eine hochauflösende Röntgenkristallstruktur zu generieren. Mithilfe der getesteten Bedingungen konnten bisher keine Kristalle der Proteine erzeugt werden. Alternativ wurde daher ein Homologiemodell der A-Domäne erstellt und das Substrat D-Hiv durch molekulares Docking in die Substratbindungstasche modelliert. Durch gezielte Mutagenese innerhalb des aktiven Zentrums konnten Erkenntnisse bezüglich des Bindungsmechanismus gewonnen werden, welche im Einklang mit dem molekularen Docking Model sind. Außerdem wurde versucht die A-Domäne zur Aktivierung von Aminosäuren umzuprogrammieren, um daraus weitere Schlüsse auf den Aktivierungsmechanismus zu ziehen und die Grundlage für weiteres Engineering der fungalen NRPSs zu legen.
