Investigation of the biosynthesis of lipolanthines, a new class of lipidated lanthipeptides

dc.contributor.advisorSüssmuth, Roderich D.
dc.contributor.authorWiebach, Vincent
dc.contributor.grantorTechnische Universität Berlinen
dc.contributor.refereeSüssmuth, Roderich D.
dc.contributor.refereeSchmitt, Lutz
dc.date.accepted2021-09-21
dc.date.accessioned2021-12-30T14:30:28Z
dc.date.available2021-12-30T14:30:28Z
dc.date.issued2021
dc.description.abstractRibosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) represent an important and constantly growing group of natural products, exhibiting diverse enzymatic modifications and promising bioactivities. One of the most thoroughly investigated RiPP-families are class-III lanthipeptides, which are characterized through the post-translational installation of two or three thioether rings as lanthionine (Lan) or labionin (Lab). While corresponding products often exhibit interesting properties as antiviral or antipain activity, they are structurally rather homogenous and only rarely exhibit additional modifications, as e.g. the glycosylation of NAI-112. The recent isolation of the strongly antibacterial lanthipeptide microvionin is therefore highly intriguing, as it not only represents the first C-terminally decarboxylated labionin structure, but furthermore exhibits an unusual N-terminal guanidino fatty acid (GFA) modification, not present within any other RiPP. Thus, microvionin does not only show promising activities against pathogens as MRSA but is the first RiPP to additionally incorporate aspects of polyketide (PK) or fatty acid (FA) biosynthesis. This work focuses on obtaining detailed insight into microvionin maturation and further evaluate the engineering potential to produce new and improved derivatives. Exhaustive genome mining efforts showed a widespread distribution of related BGCs and an unexpected biosynthetic diversity. This group of hybrid natural products, termed lipolanthines, combines elements of RiPP, polyketide, FAS and non-ribosomal peptide biosynthesis, as well as a vast diversity of additional tailoring enzymes as cytochrome P450 monooxygenases (CYPs) or glycosyltransferases (GTs). The analysis of the microvionin precursor peptide (MicA), further identified an N-terminal aliphatic θxxθxxθ recognition motif (θ = L, I, V or M), conserved within all class-III and class-IV leader peptides. Structural studies and in vitro assessment through the class-III lanthionine synthetase MicKC and the cysteine decarboxylase MicD revealed this motif to form a two-turn amphipathic α-helix. This investigation revealed both, the helical structure and hydrophobic motif, to be crucial for successful avionin (Avi) formation and led to the proposal of an unified theory on LP-recognition in class-III and class-IV lanthipeptides. Additional in vitro assays revealed a mutually regulated activity of both enzymes in which MicKC only exhibits minimal activity on its own, yet is active in the presence of MicD, whereas MicD is active alone yet strongly regulated by its enzymatic partner. Both enzymes additionally showed nearly opposite substrate requirements, as MicKC requires the conserved LP-motif, whereas MicD is selective for the respective core peptide (CP), strongly limiting the potential for subsequent engineering of microvionin derivatives. The assessment of two additional LanKC/LanD partners and a LanD-independent lipolanthine LanKC, not only revealed that diverse CPs, not modified through MicKC/MicD, are accessible by utilization of other LanKCs, but further indicated significant differences arising from the LanD-dependence. While LanD-dependent systems strictly require their enzymatic partners and exhibit mutual regulation, their “independent” counterparts readily install labionin, as observed with previously investigated LanKCs. In order to probe all aspects of microvionin maturation, two peptidases (MicP1 & MicP2), encoded far outside the respective BGC, were thoroughly characterized in vitro. Both enzymes were thereby shown to cleave the LP mainly guided by acidic residues. They however showed remarkable substrate flexibility, as they were also able to proteolytically remove a precursor peptide belonging to cyanobacterial microviridins. Overall, the herein presented work provides detailed insight into the maturation of the microvionin CP and subsequent LP removal with implications for all class-III and class-IV lanthipeptides. Furthermore, the intensive genome mining defined at least five different lipolanthine subtypes (STs), exhibiting an unprecedented biosynthetic diversity awaiting future characterization.en
dc.description.abstractRibosomal synthetisierte und posttranslational modifizierte Peptide (RiPPs) stellen eine wichtige und immer weiter wachsende Gruppe an Naturstoffen dar, die einerseits diverse interessante enzymatische Modifikationen und andererseits vielversprechende Bioaktivitäten aufweisen. Eine der am stärksten untersuchten RiPP-Familien sind dabei die Klasse III Lanthipeptide, welche sich durch die posttranslationale Installation von zwei bis drei zyklischen Thioether-Ringstrukturen wie Lanthionin (Lan) oder Labionin (Lab) auszeichnen. Während entsprechenden Produkte vielversprechende, z.B. antivirale oder schmerzstillende Bioaktivitäten aufweisen, ist die Gruppe strukturell sehr homogen und zeigt nur selten zusätzliche Modifikationen, wie z.B. eine Glykosylierung in NAI-112. Deshalb stellt das kürzlich isolierte, stark antibakterielle Microvionin hier eine faszinierende Ausnahme dar, da es nicht nur das erste Lanthipeptid mit einem C-terminal decarboxylierten Labionin ist, sondern zusätzlich eine bisher für RiPPs völlig untypische N-terminale Guanidinofettsäure-Modifiaktion aufweist. Microvionin zeigt nicht nur eine starke Inhibition von MRSA, sondern stellt auch das erste beschrieben RiPP dar, das zusätzlich Aspekte der Polyketid (PK)- bzw. Fettsäure (FA)-Synthese nutzt. Deshalb soll im Zuge diese Arbeit ein detailliertes Biosynthesemodell von Microvionin erstellt und gleichzeitig die Eignung des Biosynthesewegs zur Produktion optimierter Derivate ergründet werden. Ausführliches genome mining enthüllte hierbei eine unerwartet große Anzahl an verwandten Biosynthesegenclustern (BGCs), welche weiterhin eine enorme genetische Diversität aufweisen. Diese Gruppe an hybriden Naturstoffen wurde folgend Lipolanthine getauft, welche nicht nur Biosyntheseaspekte von PK, FA und Klasse III Lanthipeptiden beinhalten, sondern auch nicht-ribosomale Peptidsynthetasen und eine Vielzahl an zusätzlichen Modifikationsenzymen, wie Glycosyltransferasen oder Cytochrom P450-Monooxygenasen. Während der Untersuchung des Vorläuferpeptids (MicA) von Microvionin konnte zudem ein N-terminales, aliphatisches θxxθxxθ Erkennungsmotiv (θ = L, I, V oder M) in den Leaderpeptid (LP)-Sequenzen von allen Klasse III und IV Lanthipeptiden identifiziert werden. Weitergehende Strukturaufklärung und in vitro Untersuchungen der Lanthionin-Synthetase MicKC und Cystein-Decarboxylase MicD zeigten zudem, dass dieses Motiv in eine zweiwindige, amphipathische α-Helix eingebettet ist. Hierbei konnten sowohl die helikale Struktur wie auch das Motiv als essentiell für die erfolgreiche enzymatische Modifikation ermittelt und ein einheitliches Modell der Substraterkennung in Klasse III und IV Lanthipeptiden postuliert werden. Zusätzliche in vitro Studien offenbarten zudem eine vermutlich regulierte Aktivität der beiden Enzyme, in der MicKC alleine nahezu inaktiv ist und erst durch MicD aktiviert wird, wohingegen MicD alleine voll aktiv ist, diese Aktivität in Anwesenheit des Partnerenzyms jedoch stark reguliert ist. Zusammen mit einer nahezu gegensätzlichen Substratspezifität, in welcher MicKC das konservierte Erkennungsmotiv benötigt, während MicD Ansprüche an das zu modifizierende Core-Peptid zeigt, offenbarte dies jedoch massive Limitationen für die Produktion von Microvionin-Derivaten. Der folgende Einsatz zweier weiterer Enzyme der Lipolanthin Familie (LanKC/LanD), und einer LanD-unabhängigen LanKC ermöglichte jedoch die Umsetzung vorherig unzugänglicher Substrate und deutete zudem massive katalytische Unterschiede an, die aus der LanD-Abhängigkeit resultieren. Während diese LanKCs strikt auf ihren enzymatischen Interaktionspartner für die Avionin-Formation angewiesen sind und der gegenseitigen Regulation unterliegen, installieren ihre „unabhängigen“ Verwandten, auch alleine, problemlos Labionin, wie für bisherig bekannte LanKCs beobachtet wurde. Um alle Aspekte der Microvionin-Reifung zu ergründen, wurden zusätzlich zwei Peptidasen (MicP1 & MicP2) in vitro charakterisiert, deren Gene jedoch weit außerhalb des BGC liegen. Beide Enzyme schneiden hierbei das LP hauptsächlich an saure Aminosäuren. Diese Enzyme zeigen jedoch auch eine unerwartete Substratflexibilität, da sie ebenfalls in der Lage waren das LP von cyanobakteriellen Microviridinen proteolytisch zu entfernen. Zusammengefasst konnte im Zuge dieser Arbeit detaillierte Einsicht in die Modifizierung des Microvionin CPs und die folgende Entfernung des LPs gewonnen werden, inklusive Schlussfolgerungen für alle Klasse III und Klasse IV Lanthipeptide. Weiterhin konnten durch ausgiebiges genome mining mindestens fünf unterschiedliche Lipolanthine-Subtypen (ST) ermittelt und eine beeindruckende biosynthetische Vielfalt ergründet werden, die es in der Zukunft weiter zu ergründen gilt.de
dc.description.sponsorshipDFG, 385052459, Biosynthese der Avionine einer neuen Lantibiotika-Klasseen
dc.identifier.urihttps://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/13792
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.14279/depositonce-12568
dc.language.isoenen
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/en
dc.subject.ddc572 Biochemiede
dc.subject.otherlanthipeptideen
dc.subject.otherlipolanthineen
dc.subject.otherantibioticen
dc.subject.otherbiosynthesisen
dc.subject.othergenome miningen
dc.subject.otherLanthipeptidde
dc.subject.otherLipolanthinde
dc.subject.otherAntibiotikumde
dc.subject.otherBiosynthesede
dc.subject.otherGenom-Miningde
dc.titleInvestigation of the biosynthesis of lipolanthines, a new class of lipidated lanthipeptidesen
dc.title.translatedUntersuchung der Biosynthese von Lipolanthinen, einer neuen Klasse an lipidierten Lanthipeptidende
dc.typeDoctoral Thesisen
dc.type.versionacceptedVersionen
tub.accessrights.dnbfreeen
tub.affiliationFak. 2 Mathematik und Naturwissenschaften::Inst. Chemie::FG Biologische Chemiede
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tub.affiliation.groupFG Biologische Chemiede
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