Thumbnail Image

Identification of molecular effect markers of food-relevant toxic compounds

Kreuzer, Katrin

Chemicals are typically evaluated for their genotoxic and carcinogenic potential through a battery of in vitro tests and in vivo tests if necessary. While transcriptomic approaches have demonstrated that genotoxic compounds can be distinguished from non-genotoxic compounds based on transcriptomic response, these techniques are not yet widely accepted for regulatory purposes. This is due to high data variability, difficulties in data interpretation and integration with other toxicolgogical endpoints, and a lack of guidance on using omics data for regulatory riks assessment. To address these research and data gaps, this work used the metabolically competent liver cell model HepaRG to first analyze transcriptomic datasets from the literature and search for conspicuously regulated genes. Since the differences were too large due to lack of standardization, RNA sequencing was performed in HepaRG cells after treatment with five genotoxins. As far as is known, this multi-compound RNA sequencing is the first published next-generation sequencing approach in HepaRG cells to detect specific transcripts after exposure to genotoxic compounds. A 33-gene transcriptomic signature was identified, which was later successfully used for classification in a case study with the pesticide clothianidin. In order to verify whether the signature could be transferred to a non-target organ, the treatment and sequencing were repeated as similarly as possible in the p53-competent blood cell model TK6. The comparison of the two RNA sequencing experiments showed clear differences between HepaRG and TK6 cells in the regulation of the published 33-gene signature of HepaRG cells, the effects of non-genotoxins and pathway analysis. Nevertheless, it was possible to derive a gene signature from the RNA sequencing data of the TK6 cell line. In conclusion, the data show that transcriptomic responses may vary widely in different cell models despite similar experimental setups, but deriving a transcriptomic signature is possible with both approaches. This suggests that RNA sequencing is a valuable tool for identifying biomarkers, especially in combination with machine learning approaches and when metabolically competent cell lines are used. Additionally, gene expression analyses of blood samples could be a valuable approach to assess responses to toxic exposure in target organs such as the liver. Transcriptomic data can also be used to acquire new mechanistic information that will help to fill data gaps. The main obstacles to the use of transcriptomic biomarkers for regulatory purposes are lack of standards, which could be addressed by establishing a framework that provides clear guidance on methodology, validation and data analysis through independent validation bodies or international organizations.
Chemikalien werden in der Regel auf ihr gentoxisches und karzinogenes Potenzial durch eine Reihe von in-vitro-Tests und gegebenenfalls in-vivo-Tests untersucht. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass gentoxische Verbindungen auf der Grundlage der transkriptomischen Reaktion von nicht-genotoxischen Verbindungen unterschieden werden können, sind Omics-Techniken für regulatorische Zwecke noch nicht allgemein akzeptiert. Dies liegt an der hohen Variabilität der Daten aus Omics-Versuchen, an Schwierigkeiten bei der Dateninterpretation und der Verknüpfung mit anderen toxikologischen Endpunkten sowie an fehlenden Leitlinien für die Verwendung von Omics-Daten für die regulatorische Risikobewertung. Um Forschungs- und Datenlücken zu schließen, wurde in dieser Arbeit das metabolisch kompetente Leberzellmodell HepaRG verwendet, um zunächst transkriptomische Datensätze aus der Literatur zu analysieren und nach auffällig regulierten Genen zu suchen. Da die Unterschiede aufgrund mangelnder Standardisierung zu groß waren, wurde eine RNA-Sequenzierung in HepaRG-Zellen nach Behandlung mit fünf Gentoxinen durchgeführt. Soweit bekannt, ist diese RNA-Sequenzierung der erste veröffentlichte Next-Generation-Sequenzierungsansatz in HepaRG-Zellen zum Nachweis spezifischer Transkripte nach Exposition gegenüber mehreren gentoxischen Verbindungen. Es konnte eine Signatur mit 33 Genen identifiziert werden, die später in einer Fallstudie mit dem Pestizid Clothianidin erfolgreich zur Klassifizierung verwendet wurde. Um zu überprüfen, ob die Signatur auch außerhalb des Zielorgans Leber nachweisbar ist, wurden die Behandlung und die Sequenzierung in dem p53-kompetenten Blutzellmodell TK6 so ähnlich wie möglich wiederholt. Der Vergleich der beiden RNA-Sequenzierungen zeigte deutliche Unterschiede zwischen HepaRG- und TK6-Zellen in der Regulation der 33 Gene der Signatur, der Antwort auf Nicht-Gentoxinen und der Pathway-Analyse. Dennoch war es möglich, eine weitere Gensignatur aus den RNA-Sequenzierungsdaten der TK6-Zelllinie abzuleiten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass in verschiedenen Zellmodellen transkriptomische Reaktionen trotz ähnlicher Versuchsaufbauten stark variieren können; die Ableitung einer transkriptomischen Signatur ist aber mit beiden Ansätzen möglich. Dies deutet darauf hin, dass die RNA-Sequenzierung ein wertvolles Instrument für die Identifizierung von Biomarkern ist, insbesondere in Kombination mit maschinellem Lernen und wenn metabolisch kompetente Zelllinien verwendet werden. Darüber hinaus könnten Genexpressionsanalysen von Blutproben ein wertvoller Ansatz sein, um Reaktionen auf Exposition von Gentoxinen in Zielorganen wie der Leber zu bewerten. Zudem können transkriptomische Daten genutzt werden, um neue mechanistische Informationen zu liefern und Datenlücken zu schließen. Die Hindernisse, die der Verwendung von transkriptomischen Biomarkern für regulatorische Zwecke noch im Wege stehen, sind hauptsächlich auf fehlende Standards zurückzuführen. Das könnte durch die Schaffung eines Rahmens mit klaren Leitlinien für Methodik, Validierung und Datenanalyse durch unabhängige Validierungsstellen oder internationale Organisationen angegangen werden.