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Künstliche und native Biomembransysteme auf planaren Substraten sowie auf Partikeloberflächen
Tutus, Murat
Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, durch die Kombination verschiedener Oberflächenfunktionalisierungsmethoden und biophysikalischer Techniken Biomembranreaktoren aus künstlichen wie natürlichen Biomembranen auf verschiedenen Festkörperoberflächen herzustellen, um diese auf ihre technische Anwendungsmöglichkeit hin zu untersuchen. Der erste Teil beschreibt die Etablierung einer neuen, gerichteten Einbaumethode für große transmembrane Proteine (FOF1 ATP-Synthase, MW = 550 kDa) durch den Einsatz eines „schwachen“ Detergens, welches die Lipidmembran gering stört. Mit Hilfe Dynamischer Lichtstreuung wurde gezeigt, daß der Einbau der Proteine in die Lipidmembran ohne deren Zerstörung erfolgte. Obwohl es nicht möglich ist, Proteoliposomen auf Glas- oder Quartzoberflächen aufzuspreiten, konnten Membranen mit einheitlich präsentierenden F1 Köpfen auf ultradünnen Zellulosefilmen (5 – 10 nm) ausgebildet und mit der Rasterkraftmikroskopie und Antikörpermarkierung beobachtet werden. Das zweite und dritte Kapitel beschreibt die Immobilisierung zwei verschiedener natürlicher Membranen (Ghostzellen aus humanen Erythrozyten und Fragmente des Sarkoplasmatischen Retikulums aus Kaninchenmuskeln) auf Silicamikropartikel. Silicamikropartikel bieten einen besonderen Vorteil gegenüber planaren Oberflächen: Auf den Partikeloberflächen können mit geringem Aufwand künstliche und natürliche Membranen ohne eine biokompatible Zellulosebeschichtung immobilisiert werden. Darüber hinaus bieten Partikel eine größere, zugänglichere Oberfläche, wodurch das Signal von Membranproteinen signifikant erhöht wird. Der erste Aspekt wird in Kapitel 2 untersucht, in dem demonstriert wird, daß die Aufspreitkinetik von Ghostzellmembranen tatsächlich von der Partikelgröße und somit dem Kontaktwinkel abhängig ist. Kapitel 3 schließlich beschreibt die Entwicklung eines Prototyps eines Membranbioreaktors mit beschichteten Silicapartikeln in einer Chromatographiesäule. Dieser Aufbau erlaubt die vereinfachte Beobachtung der quantitativen Funktion der Ca2+ ATPase in Membranen des Sarkoplasmatischen Retikulums. Die ermittelten Daten demonstrieren eindrucksvoll, daß die Kombination von Oberflächenchemie, Biophysik und Bioverfahrenstechnologie eine leistungsfähige Strategie zur Entwicklung von biochemischen Membranbioreaktoren ist.
The primary aim of the thesis is to explore the potential applications of artificial and native biomembranes immobilized on various solid substrates as biomicroreactors by the combination of various surface functionalization methods and biophysical techniques. In the first part, a new strategy to incorporate large transmembrane proteins (FOF1 ATP synthase, MW = 550 kDa) in an orientation selective manner is established by the use of weak detergents that are much less aggressive to lipid membranes. Dynamic light scattering demonstrated the incorporation of proteins into lipid vesicles without disrupting membrane structures. Although it is not possible to spread proteoliposomes on bare glass/quartz substrates, the formation of membranes uniformly displaying F1 head groups could be observed on ultrathin cellulose films (thickness: 5 – 10 nm) by the use of atomic force microscopy and immunofluorescence microscopy. In the second and third chapter, two kinds of native membranes (human erythrocyte ghost membranes and rabbit sarcoplasmic reticulum membranes) are deposited onto silica microparticles, which can offer unique advantages over planar supports: They allow a less laborious immobilization of membranes because both artificial and native membranes can be deposited without biocompatible cellulose coatings. Moreover, the particle supports can provide much larger accessible surface areas, which enables one to amplify the signal from membrane proteins significantly. The first aspect is investigated in Chapter 2, where it is being demonstrated that the spreading kinetics of erythrocyte ghost membranes actually depend on the particle size (contact curvature). In Chapter 3, a prototype of membrane bioreactor is designed by packaging particle-supported membranes in a chromatography column, which allows the easy monitoring of the quantitative function of Ca2+ ATPase in sarcoplasmic reticulum membranes. The obtained results demonstrate that the combination of surface chemistry, biophysics, and bioengineering is a powerful strategy towards the design of biochemical membrane microreactors.
