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Die Rolle von Annexin A1 im Tiermodell der rasch progressiven Glomerulonephritis
Labes, Robert
Die anti-glomeruläre Basalmembran-Antikörper vermittelte Glomerulonephritis (a-GBM-Glomerulonephritis) ist eine ernstzunehmende Erkrankung, welche zum chronischen Nierenversagen führen kann. Die Dialyse ist neben der Transplantation die wichtigste Möglichkeit zur Behandlung eines terminalen Nierenversagens und geht mit einer erheblichen Einschränkung der Lebensqualität einher. Die chronische Niereninsuffizienz stellt zudem ein hohes Mortalitätsrisko dar.
Die a-GBM-Glomerulonephritis wird unter anderem mit Glucocorticoiden behandelt, die sowohl antiinflammatorische als auch anti-fibrotische Eigenschaften besitzen. Viele dieser Effekte werden durch das glucocorticoid induzierbare Protein Annexin A1 (AnxA1) vermittelt. Das 37 kDa große Protein wird z. B. in Immunzellen, wie Neutrophile und Makrophagen, exprimiert. In der Niere ist AnxA1 in Podozyten, Zellen der Bowman-Kapsel und der Macula densa sowie Fibroblasten lokalisiert. Viele seiner Effekte werden durch den G-Protein gekoppelten Formylpeptidrezeptor 2 (FPR2) vermittelt.
Über die Regulation und die Auswirkungen von AnxA1 während einer a-GBMGlomerulonephritis ist bisher wenig bekannt. Daher war die Zielstellung der Arbeit die Analyse der Auswirkungen einer experimentellen a-GBM-Glomerulonephritis auf die AnxA1-Expression sowie die Untersuchung eines Einflusses einer AnxA1-Defizienz auf den Krankheitsverlauf. Hierfür wurde die Nephritis durch Injektion eines nephrotoxischen Schaf-Serums, welches Antikörper gegen die glomeruläre Basalmembran enthält, sowohl in Wildtyp als auch AnxA1-defizienten Mäusen induziert. Die Auswertung der untersuchten Parameter erfolgte dabei jeweils 5 d und 10 d nach Nephritisinduktion. Die AnxA1-Expression wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung, quantitativer reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und Western Blot ermittelt. Für eine Bewertung des Krankheitsverlaufes wurde die Proteinausscheidung im Urin bestimmt sowie histologische Färbungen herangezogen. Der Einfluss der AnxA1-Defizienz wurde anhand der renalen Leukozyteninfiltration, der Eicosanoid-Abundanz sowie einer mRNA-Quantifizierung verschiedener Zytokine analysiert. Des Weiteren wurde die Kollagen-Abundanz zur Einschätzung des Fibrosierungsgrades durch in-situ-Hybridisierung, qPCR und Sirius Rot-Färbung im Verlauf der experimentellen a-GBM-Glomerulonephritis ermittelt. Zusätzlich wurde die Regulation der Genaktivität in Bezug auf den AnxA1-Mangel durch Next Generation Sequencing analysiert.
Im Verlauf der experimentellen a-GBM-Glomerulonephritis konnte eine gesteigerte AnxA1-Expression mit der höchsten Abundanz 10 d nach Nephritisinduktion gezeigt werden. In AnxA1-defizienten Mäusen zeigte sich eine deutliche Steigerung von Nierenschädigungsparametern wie erhöhte Proteinurie, glomeruläre Sklerosen und eine glomeruläre Halbmondbildung. Die Infiltration der Niere mit Leukozyten, welche während der experimentellen a-GBM-Glomerulonephritis beobachtet wurde, war in AnxA1-defizienten Tieren deutlich erhöht. Zusätzlich zeigte sich eine Zunahme der pro- bei gleichzeitiger Abnahme der antiinflammatorischen Eicosanoiden. Im Vergleich zu Wildtyp Tieren war die Expression der Kollagen mRNA sowie die Ablagerung extrazellulären Kollagenfibrillen in AnxA1-defizienten Tieren ebenfalls erhöht. In vivo konnte durch den Vergleich von Wildtyp und AnxA1-defizienten Tieren während der experimentellen a-GBM-Glomerulonephritis eine Reihe von Genen mittels Next Generation Sequencing ermittelt werden, deren Expression in Abhängigkeit von AnxA1 erfolgt. Durch eine Überrepräsentationsanalyse konnten diese Gene vor allem inflammatorischen Prozessen zugeordnet werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine Schlüsselfunktion von AnxA1 in der zellulären Adaptation während einer a-GBM-Glomerulonephritis auf. Sowohl inflammatorische als auch fibrotische Prozesse werden in vivo durch AnxA1 beeinflusst. Anhand dieser Daten rückt das glucocorticoid induzierbare Protein AnxA1 in den Fokus für mögliche neue Therapieansätze bei der Behandlung entzündlicher Nierenerkrankungen.
Acute kidney disease like the anti-glomerular basement membrane disease (a-GBM-disease) are serious diseases which may give rise to chronic kidney disease. The treatment of end stage renal disease with dialysis is accompanied with a reduction in life quality. Additionally chronic kidney disease contribute to a increased mortality.
For the treatment of a-GBM-disease glucocorticoids play an important role. They exhibit anti-inflammatory and anti-fibrotic effects. A broad range of these effects are mediated by the glucocorticoid inducible protein Annexin A1 (AnxA1). The protein is expressed by different cells like neutrophils or macrophages. In the kidney AnxA1 expressing cells include podocytes, cells from the Bowman’s capsule and Macula densa as well as interstitial fibroblasts. Many of the anti-inflammatory and anti-fibrotic effects are mediated by the G-protein coupled receptor formylpeptide receptor-2.
The regulation and influence of AnxA1 during the course of a-GBM-disease are largely unknown. Therefore these aspects should be analyzed in a setting of experimental a-GBM-Glomerulonephritis in wildtype and AnxA1 deficient mice. Nephritis was induced by injection of a nephrotoxic sheep serum, which contains antibodies directed against the glomerular basement membrane. Animals were sacrificed 5 d and 10 d after induction. AnxA1 expression was analyzed by immunofluorecence staining, quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qPCR) and western blot. To assess the impact of AnxA1 deficiency on the course of the experimental a-GBM-glomerulonephritis, the urinary protein excretion and kidney morphology was evaluated. Additionally renal immune cell abundance was quantified by flow cytometry and eicosanoid as well as cytokine levels were measured. Fibrosis was evaluated by in situ hybridization and qPCR analysis of collagen mRNA together with Sirius red staining of extracellular collagen fibers. In addition the influence of AnxA1 deficiency on the regulation of gene activity was assessed by next generation sequencing (NGS).
During the course of experimental a-GBM-glomerulonephritis the AnxA1 abundance was elevated with highest expression 10 d after nephritisinduction. Lack of AnxA1 showed severe influences on the outcome of the experimental disease. Animals lacking AnxA1 showed increased proteinurie as well as aggravated kidney damage. The amount of infiltrating leukocytes was increased together with elevated pro-inflammatory eicosanoid abundance. In parallel, the amount of antiinflammatory lipids was decreased in AnxA1 deficient mice. Quantification of collagen mRNA and extracellular collagen showed an increased abundance in mice lacking AnxA1. NGS analysis revealed several differentially expressed genes in AnxA1 deficient mice. Most of these genes could be assigned by gene overrepresentation analysis to inflammatory pathways.
These data suggest a major role of AnxA1 in the regulation of inflammatory and fibrotic processes during experimental a-GBM-glomerulonephritis. In conclusion AnxA1 deficiency resulted in aggravated kidney damage with increased inflammation and fibrosis. In respect to these results AnxA1 may provide a new therapeutic target for the treatment of inflammatory kidney diseases.
