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The role of mechanical forces in osteogenic differentiation, BMP signaling and early tissue formation processes in the context of bone healing
Görlitz, Sophie
During bone fracture healing, cells are simultaneously subjected to extrinsic mechanical forces and to a variety of biochemical signals including the indispensable and clinically applied growth factor Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2). In vivo experiments provide evidence that mechanical forces promote BMP-2-induced bone defect healing and in vitro studies report about a potentiation of BMP signaling by mechanical stimuli. Clinically, supra-physiological BMP-2 concentrations are used for fracture treatment, which can cause various side effects. Fine-tuned mechanical stimuli, either resulting from extrinsic loading or featured by advanced biomaterials, could in future improve the growth factor application by increasing its efficiency. However, to employ the power of the mechano-biochemical interaction, a deeper understanding how both stimuli control cell behavior independently and in combination is needed.
In this dissertation, the influence of extrinsic mechanical forces and BMP-2 on osteogenic cell differentiation and early tissue formation processes was investigated in vitro and the molecular mechanism underlying the mechano-regulated BMP signaling were explored. To realize in vivo loading scenarios in the well-controlled environment of an in vitro screening system, mechano-bioreactors in combination with 3D biomaterial matrices were utilized throughout this study.
In contrast to data from literature, osteogenic differentiation of primary human mesenchymal stromal cells was found to be down-regulated under cyclic compression. This could be explained by the specific experimental conditions that excluded autocrine stimulation. When the enrichment of secreted factors including BMP-2 in the cell culture medium was permitted, cyclic compression promoted osteogenic differentiation as it was observed under direct supplementation of BMP-2. Based on these observations, it was concluded that mechanical stimulation induces osteogenesis indirectly through a mechanically controlled secretion of BMP-2 and the resulting biochemical self-stimulation. This interpretation was underpinned by the absence of load-induced osteogenic differentiation when a specific BMP inhibitor was supplemented.
Besides a mechano-regulated increase in BMP-2 expression and secretion, mechanical stimuli trigger mechanotransduction pathways that directly crosstalk to BMP signaling enhancing Smad phosphorylation and target gene expression. However, the mechanical requirements and the molecular mechanism causing the crosstalk are poorly understood. By a systematic variation of the mechanical loading schemes, it was shown for the first time that cells feature a mechanical memory that leads to an increased signaling response to BMP-2 even when the mechanical signal has vanished. The mechanical memory is active upon long-term stimulation and is based inter alia on an enhanced and sustained expression of the BMP receptor type 1B. While transcriptional regulations are suggested to be an integral part of the mechanical memory, the immediate early induction of Smad phosphorylation upon concurrent mechanical and biochemical (BMP-2) stimulation is independent of any transcriptional regulation. Instead, specific integrin knockdown and F-actin stabilization experiments
revealed that integrin αv as well as load-induced integrin and actin cytoskeleton remodeling are required for the immediate mechano-regulation of BMP signaling.
The relevance of the crosstalk for early tissue formation was investigated in the last part of the project. While, cyclic compression alone specifically altered mechanical, structural and compositional matrix cues, BMP-2 treatment had only minor effects. In a combination of both stimuli, the effects of cyclic compression were therefore dominating and no synergistic effects could be observed. Even though a role of the crosstalk for early tissue formation could not be verified, new insides into how mechanical stimulation influences ECM formation have been gained.
Taken together, this dissertation contributes to a profound understanding of how mechanical forces regulate osteogenic differentiation, BMP signaling and early tissue formation, processes, which are relevant in the context of bone regeneration. In a long-term perspective, these findings could help to optimize mechanical boundary conditions with respect to BMP signaling to increase the efficacy and safety of therapeutically used BMP-2. This study highlights the role of mechano-biochemical interactions in controlling cell behavior and motivate further research on growth factor signaling in a mechanical context.
Während der Knochenheilung sind Zellen gleichzeitig mechanischen Kräften und einer Vielzahl von biochemischen Faktoren, einschließlich des klinisch angewandten Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2), ausgesetzt. In vivo Experimente deuten darauf hin, dass mechanische Kräfte die BMP-2-induzierte Knochendefektheilung fördern und in vitro Studien konnten eine Verstärkung des BMP Signalweges durch mechanische Stimulation zeigen. Zur klinischen Behandlung werden noch immer supra-physiologische BMP-2 Konzentrationen verwendet, die verschiedene Nebenwirkungen verursachen können. Optimierte mechanische Stimuli, ausgehend von extrinsischer Belastung oder von einem Biomaterial, könnten zukünftig dazu genutzt werden, die Effizienz des Wachstumsfaktors zu überhöhen. Um sich diese Interaktion zunutze zu machen, muss jedoch zunächst verstanden werden wie beide Stimuli unabhängig und abhängig voneinander das Zellverhalten beeinflussen.
In dieser Dissertation wurde sowohl der Einfluss von extrinsischen mechanischen Kräften und BMP-2 auf die osteogene Zelldifferenzierung und Gewebebildung untersucht, als auch der molekulare Mechanismus der der mechanischen Regulierung des BMP-Signalweges zugrunde liegt, erforscht. Um in vivo Belastungsbedingung in einer 3D Umgebung nachzubilden, wurde ein Bioreaktorsystem in Kombination mit makroporösen Biomaterialien in dieser Studie verwendet.
Im Gegensatz zu Literaturdaten, wurde die osteogene Differenzierung primärer humaner mesenchymaler Stromazellen durch zyklische Kompression herunterreguliert. Dies konnte durch die speziellen experimentellen Bedingungen erklärt werden, die eine autokrine Stimulation ausschlossen. Wenn eine Anreicherung von sezernierten Faktoren, einschließlich BMP-2, im Zellkulturmedium zugelassen wurde, förderte die zyklische Kompression jedoch die osteogene Differenzierung, was auch unter Supplementierung von BMP-2 beobachtet wurde. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der Schluss gezogen, dass die mechanische Stimulation die Osteogenese indirekt durch eine mechanisch kontrollierte Sekretion von BMP-2 und die daraus resultierende biochemische Selbststimulation induziert wird. Diese Interpretation wurde dadurch untermauert, dass eine Zugabe eines spezifischen BMP-Inhibitors zum Ausbleiben einer belastungsinduzierten osteogenen Differenzierung führte.
Neben einer mechano-regulierten Erhöhung der BMP-2-Expression lösen mechanische Stimuli Mechanotransduktionswege aus, die direkt mit dem BMP-Signalweg interagieren und die Smad-Phosphorylierung und die Expression von Zielgenen verstärken. Allerdings sind die mechanischen Anforderungen für eine Interaktion und der zugrundeliegende molekulare Mechanismus nur unzureichend verstanden.
Durch Variation der Belastungsparameter wurde erstmals festgestellt, dass Zellen bei langfristiger Vorstimulation ein mechanisches Gedächtnis entwickeln, welches sich auf den BMP-Signalweg auswirkt. Dieses Gedächtnis wird unter anderem durch eine belastungsinduzierte Erhöhung der BMP-Rezeptor-Typ-1B-Expression verursacht. Während transkriptionelle Regulationen für die Ausbildung eines mechanischen Gedächtnisses von großer Wichtigkeit sind, ist die sofortige und frühe Induktion der Smad-Phosphorylierung
durch gleichzeitiger mechanischer und BMP Stimulation unabhängig von einer Transkriptionsregulierung. Stattdessen konnte durch einen spezifischen Integrin-Knockdown und eine F-Aktin-Stabilisierung gezeigt werden, dass αv Integrine und der belastungsinduzierte Integrin- und Zytoskelettumbau für die sofortige Mechano-Regulation des BMP-Signalweges erforderlich sind.
Die Bedeutung der Interaktion für die frühe Gewebebildung wurde im letzten Teil des Projekts untersucht. Während die zyklische Kompression spezifisch mechanische, strukturelle und kompositorische Matrixeigenschaften veränderte, hatte die BMP-2-Behandlung nur geringe Auswirkungen. Bei einer Kombination beider Stimuli dominierten daher die Effekte der zyklischen Kompression und es konnten keine synergistischen Effekte beobachtet werden. Obwohl eine Rolle der Mechano-Regulation des BMP-Signalweges für die frühe Gewebebildung nicht verifiziert werden konnte, wurden neue Erkenntnisse darüber gewonnen, wie mechanische Stimulation die Bildung der extrazellulären Matrix beeinflusst.
Zusammengenommen tragen die Ergebnisse diese Dissertation zu einem tiefgreifenden Verständnis darüber bei, wie mechanische Kräfte die osteogenen Differenzierung, den BMP-Signalweges und frühe Gewebebildungsprozesse im Kontext der Knochenheilung regulieren.
In Zukunft könnten diese Erkenntnisse dazu beitragen, die mechanischen Randbedingungen in Bezug auf den BMP-Signalweg zu optimieren, um die Wirksamkeit und Sicherheit von therapeutisch eingesetztem BMP-2 zu erhöhen. Die Ergebnisse heben die Rolle mechano-biochemischer Wechselwirkungen bei der Steuerung des Zellverhaltens hervor und motivieren zu weiteren Forschungen zur Wachstumsfaktorsignalwegen in einem mechanischen Kontext.
