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Identification and characterization of causative variants of periodontitis in the gene ST8SIA1
Chopra, Avneesh
Genome-wide association studies have identified various susceptibility loci with periodontal diseases. However, firmly establishing the causality of a disease-associated variant and understanding how it contributes to disease development requires assigning causal alleles and explicitly demonstrating their molecular functionality and identifying their target gene(s). The identification of non-coding variants that affect gene expression is a crucial challenge because associated haplotypes often comprise numerous putative regulatory elements. In this work, a scalable qRT-PCR reporter gene system was developed to enable the parallel analysis of multiple regulatory elements within the same experimental setting. This system was used to identify putative causal variants of a genetic association at the gene ST8SIA1 that increased the risk of periodontitis in smokers.
The system’s sensitivity to detect reporter gene activity was validated for known and predicted regulatory sequences with luciferase reporter assay. Subsequently, the parallel reporter gene assays were used to quantify the regulatory activity of chromatin elements with predictive features of regulatory function at SNPs within the gene ST8SIA1, and to determine the directions and allele-specific effects on gene expression. Antibody electrophoretic mobility shift assay was performed to test whether the putative causal variant changed predicted transcription factor binding. CRISPR/dCas9 activation and RNA-Sequencing were applied to pinpoint ST8SIA1 as the target gene of the association, to identify genetic interaction partners of ST8SIA1 and to determine the functions of ST8SIA1 in the cell.
Two repressor elements in the associated haplotype block at ST8SIA1 that bind the transcriptional repressor BACH1 were identified. The putative effect T-allele of rs2012722 decreased BACH1 binding by 40%. ST8SIA1 was pinpointed as a target gene of the association. RNA-Sequencing following endogenous activation of ST8SIA1 positively correlated with the strongest increase in expression of the suggestive periodontitis risk gene ABCA1. Gene set enrichment analysis showed the highest effects on integrin cell surface interactions and cell cycle regulation.
In summary, a functional reporter gene system that facilitates parallel enhancer screening was developed and an experimental pipeline for identification and characterization of causal variants and their target genes was established. This study identified the putative causal variant and describes a molecular mechanism underlying the association. It established ST8SIA1 as the target gene and placed it into a functional network with ABCA1. It was concluded that impaired ST8SIA1 repression, independently caused by reduced BACH1 binding at the effect T-allele as well as by tobacco smoke, contribute to upregulation of ST8SIA1, could be harmful for the gingival barrier integrity and periodontal wound healing.
Genomweite Assoziationsstudien haben verschiedene Suszeptibilitätsloci mit parodontalen Erkrankungen identifiziert. Um jedoch die Kausalität einer krankheitsassoziierten Variante festzustellen und zu verstehen, wie sie zur Krankheitsentwicklung beiträgt, ist es erforderlich, die kausalen Allele zuzuordnen und ihre molekulare Funktionalität explizit nachzuweisen sowie ihre Zielgene zu bestimmen. Die Identifizierung von nicht-kodierenden Varianten, die die Genexpression beeinflussen, ist eine wesentliche Herausforderung, da assoziierte Haplotypen oftmals zahlreiche putative regulatorische Elemente umfassen. Daher wurde ein skalierbares qRT-PCR-Reportergen System zur parallelen Quantifizierung regulatorischer Elemente entwickelt und zur Charakterisierung einer angezeigten Assoziation im Gen ST8SIA1, welche das Risiko für Parodontitis bei Rauchern erhöht, verwendet.
Die Detektionssensitivität der Reportergenaktivität wurde für bekannte und vorhergesagte regulatorische Sequenzen mit dem Luciferase-Reportergen Assay validiert. Nachfolgend wurden die entwickelten parallelen Reportergen-Assays verwendet, um regulatorische DNA-Elemente an den ST8SIA1-assoziierten SNPs zu identifizieren, deren Chromatin Modifikationen regulatorische Funktionen vermuten ließen. Mit den Reportergen Assays konnte die Wirkungsrichtung und allel-spezifische Effekte auf die Transkription dargestellt und quantifiziert werden. Ein Antikörper-Electrophoretic Mobility Shift Assay wurde durchgeführt, um zu testen, ob die putative kausale Variante die vorhergesagte Transkriptionsfaktor-Bindung verändert. Die CRISPR/dCas9-Aktivierung und RNA-Sequenzierung wurden angewandt, um ST8SIA1 als Zielgen der Assoziation festzulegen und genetische Interaktionspartner von ST8SIA1 sowie die Funktionen von ST8SIA1 in der Zelle zu identifizieren.
Zwei Repressorelemente im assoziierten Haplotyp-Block bei ST8SIA1, die den transkriptionellen Repressor BACH1 binden, wurden identifiziert. Das putative Effektallel T von rs2012722 reduzierte die BACH1-Bindung um 40%. ST8SIA1 wurde als ein Zielgen der Assoziation identifiziert. Die RNA-Sequenzierung nach endogener Aktivierung von ST8SIA1 korrelierte positiv mit dem stärksten Anstieg der Expression des angezeigten Parodontitis-Risikogens ABCA1. Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse zeigte die stärksten Effekte auf Integrin-Zelloberflächeninteraktionen und Zellzyklusregulation.
Zusammenfassend wurde ein Reportergen System entwickelt, das ein paralleles Enhancer-Screening ermöglicht, und eine experimentelle Pipeline zur Identifizierung und Charakterisierung von kausalen Varianten und ihren Zielgenen etabliert. Diese Studie identifizierte die putative kausale Variante und beschreibt einen molekularen Mechanismus, der der Assoziation zugrunde liegt. Sie stellte ST8SIA1 als Zielgen fest und brachte es in ein funktionelles Netzwerk mit ABCA1 zusammen. Die gewonnenen Ergebnisse erlaubten die Schlussfolgerung, dass eine reduzierte BACH1-Bindung am Effektallel T die Expression von ST8SIA1 erhöht. Die dadurch verstärkte Expression ist additiv zu den Effekten von Tabakrauch, der unmittelbar zu einer Hochregulation von ST8SIA1 beiträgt. Diese additive Verstärkung der ST8SIA1 Expression kann die Integrität der gingivalen Barriere und der parodontalen Wundheilung beeinträchtigen.
