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Analysis of the derivation phase of human adipose tissue-derived multipotent mesenchymal stromal cells
Braun, Julian
Mesenchymale Stromazellen (MSC) sind in vitro gekennzeichnet durch plastik-adhärente Proliferation, einen spezifischen Immunphänotyp und Multipotenz. Die in vivo Zelltypen, die zu MSC werden (MSC-Vorläufer), wurden kürzlich als perivaskuläre Zellen beschrieben. Allerdings müssen diese MSC-Vorläufer besser charakterisiert und geklärt werden, ob die MSC-Vorläufer bereits in vivo die in vitro-Eigenschaften von MSC aufweisen, oder diese erst während der in vitro Kultur annehmen. Um diese Frage zu beantworten, haben wir Morphologie, Proliferation und Immunphänotyp sowie Trankriptom von humanen MSC-Vorläufern während der frühen in-vitro-Kultur Phase, der "MSC-Ableitungsphase" analysiert.
Potenzielle human MSC-Vorläufer aus dem Fettgewebe (AT-MSC) wurden mittels multi-parametrischer Durchflusszytometrie charakterisiert, unter Verwendung diverser MSC-Vorläufer-Marker, z.B. CD34, CD105, CD146 und CD271. Die MSC-Vorläufer wurden in engen Kinetiken während der frühen Kultur überwacht. Zwei AT-MSC-Vorläufertypen wurden identifiziert: CD34+ CD146- CD271+/- adventitielle Stromazellen (AdSC) und CD34- CD146+ CD271+/- Perizyten (PC). AdSC proliferierten schneller, auch unter MSC-Kulturbedingungen, während die ex-vivo-Expansion von PC auf Endothelzell-typische Kulturbedingungen beschränkt war. Am Tag 4 der frühen In-vitro-Kultur wurden MSC-Vorläufer fibroblastoid und regulierten CD105, CD146 und CD271 hoch. Gleichzeitig begannen die AdSC zu proliferieren und CD34 herunterzuregulieren.
Der Vergleich der Transkriptome von ex vivo sortierten und 14-Tage-kultivierten AdSC mittels Microarray und „Gene Set Enrichment Analysis“ ergab, dass ex vivo AdSC quieszent waren, und dass die Aktivierung in vitro wahrscheinlich durch frühe Entzündungsreaktionen, ausgelöst durch Zellisolation, induziert und durch PDGF und FGF-Signale und, vorallem durch Dickkopf-1-vermittelte Hemmung des Wnt-Signalwegs reguliert wurden.
Diese Studie stellt die erste detaillierte Analyse der Veränderungen in den Eigenschaften der MSC-Vorläufer während der frühen Kultur dar. Der Vergleich von AdSC und PC ergab nicht nur, dass MSC-Ableitung aus unterschiedlichen Vorläufern kulturabhängig ist, sondern auch, dass AdSC die klonogensten AT-MSC-Vorläufer sind. Desweiteren haben wir eine reproduzierbare Abfolge phänotypischer Veränderungen während des MSC-Ableitungsprozesses entdeckt, die mit inflammationsbedingter Aktivierung und Proliferation korreliert und für den Erwerb des MSC-typischen Phänotyps durch AdSC essentiell ist.
Mesenchymal stromal cells (MSC) are characterized in vitro by plastic-adherent proliferation, a specific immunophenotype and multipotency. The in vivo cell types giving rise to MSC, referred to as MSC progenitors, have been recently described as perivascular cells. However, further characterization of these MSC progenitors is necessary and it remains to be elucidated whether the in vitro characteristics of MSC are intrinsic to MSC progenitors in vivo or are acquired upon in vitro culture. We addressed this question by analyzing morphology, proliferation, immunophenotype and transcriptome of human MSC progenitors during the early in vitro culture phase, the “MSC derivation phase”.
To identify potential human adipose tissue-derived MSC (AT-MSC) progenitors, stromal vascular cell subsets were characterized by multi-parametric flow cytometry using diverse MSC progenitor markers, such as CD34, CD105, CD146 and CD271. Further, MSC progenitor subsets were monitored during early culture in tight kinetic analyses to determine changes in morphology, proliferation, and immunophenotype. We identified two AT-MSC progenitor subsets: CD34+CD146-CD271+/- adventitial stromal cells (AdSC) and CD34-CD146+CD271+/- pericytes (PC). During early in vitro culture, AdSC exhibited high proliferative capacity, also under MSC culture conditions, whereas proliferation of PC was restricted to endothelial culture conditions. The kinetic analysis revealed that MSC progenitors became fibroblastoid as early as day 4 and upregulated CD105, CD146 and CD271. Accompanying this phenotypic transition, AdSC commenced proliferation and downregulated CD34.
Comparing transcriptomes of ex vivo sorted and 14-days-cultured AdSC by microarray and Gene Set Enrichment Analysis revealed that ex vivo AdSC were quiescent and that activation was induced in vitro probably by early inflammatory responses triggered by cell isolation and that proliferation was regulated by PDGF and FGF signaling and, most importantly, inhibition of WNT signaling by Dickkopf-1.
In this study, we provide the first detailed analyses of early culture-mediated changes in the properties of human MSC progenitors. Comparing AdSC and PC during early in vitro culture demonstrated not only that MSC derivation from different progenitor subsets is culture-dependent, but also that AdSC are the most clonogenic AT-MSC progenitors. Moreover, we identified a highly reproducible sequence of phenotypic changes during the MSC derivation process which is associated with inflammation-induced activation and proliferation and is necessary for AdSC to acquire the typical MSC phenotype.
