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In dieser Arbeit wurde Resonanz-Raman-Spektroskopie (RR-Spektroskopie) eingesetzt, um Strukturen von Chromophoren aus mikrobiellen Rhodopsinen, insbesondere Channelrhodopsin-2 (ChR2), Histidin-Kinase-Rhodopsin-1 (HRK1) und Xanthorhodopsin (XR) in ihren Dunkel- sowie in den Zwischenzuständen des Photozyklus zu untersuchen. Die Zuordnung der Strukturen erfolgte durch Vergleich mit RR-Spektren von Bacteriorhodopsin (BR), dessen verschiedene Konformationen bekannt sind. ChR2 wurde dafür bei Raumtemperatur und unter kryogenen Bedingungen untersucht. Dabei wurden jeweils verschiedene Anregungsbedingungen verwendet um selektiv den Dunkel- bzw. die Zwischenstände P500 und P390 untersuchen zu können. Eine vorgenommene Bandenanpassung für die erhaltenen Spektren insbesondere im C=C Streckschwingungsbereich unter Zuhilfenahme von Banden mit Lorentzprofilen zeigte, dass der Dunkelzustand (D470) sich aus zwei verschiedenen Isomeren zusammensetzt. Vermutlich handelt es sich dabei um die Isomere mit den Konformationen all-trans, 15-anti bzw. 13-cis, 15-syn, wobei beide eine protonierte Schiff’sche Base des Retinals (RSB) aufweisen, wie im Falle des dunkel-adaptierten BR und Rh-B1 in HKR1. Der Photozyklus wird überwiegend durch eine 13-trans/cis Isomerisierung eingeleitet, die zu einem Zwischenzustand mit einer 13-cis, 15-anti Konformation des Retinals führt, wie sie für den P390 Zustand in der Mutante ChR2-C128S-D156A mit einem langsamen Photozyklus gefunden wurde. Die photoinduzierte Isomerisierung des 13-cis Isomers des Dunkelzustandes scheint hingegen weniger effizient zu sein, falls sie überhaupt auftritt. Eine genauere Analyse der C=NH+ Streckschwingungen der beiden Isomere des Dunkelzustandes deutet daraufhin, dass im Falle des all-trans Isomers im Vergleich zum 13-cis Isomer das Wassermolekül sich näher an der RSB befindet. Der Photozyklus von ChR2-C128T beinhaltet als Seitenreaktion eine reversible Hydrolyse der Schiff’schen Base des Retinals (P353). Trotz der Ähnlichkeiten in den Feinstrukturen in den Absorptionsspektren unterscheidet sich die Konfiguration des Retinals in P353 von der eines reduzierten und UV-bestrahlten Chromophors in BR wie mittels RR-Spektroskopie gezeigt wurde. Für das Retinal im Dunkelzustand (Rh-UV) von HKR1 wurde eine 13-cis, 15-anti Konfiguration mit einer deprotonierten RSB gefunden, ähnlich zum M-Zwischenzustand von BR aber dafür thermisch stabil. Es konnte gezeigt werden, dass die photoinduzierte Umwandlung von Rh-UV in einen stabilen Zwischenzustand (Rh-B1) mit einer 13-cis/trans oder 15-anti/syn Isomerisierung verbunden ist, die folglich zur Akkumulation beider Retinalisomere (all-trans, 15-anti und 13-cis, 15-syn) führt. Zusätzlich zu Retinalen enthält XR ein photoinaktives Carotenoid, welches ein Absorptionsspektrum aufweist, das das des Retinals überlagert. Mittels Verwendung einer Anregungswellenlänge die im langwelligen Bereich der Absorption liegt, konnten RR-Signale der Retinale erhalten werden. Deren Struktur konnte mit einer, für mikorbielle Rhodopsine typische all-trans, 15-anti Konfiguration bestimmt werden.
Resonance Raman spectroscopy has been employed to determine the chromophore structure in the dark and intermediate states of various microbial rhodopsins, i.e., channelrhodopsin-2 (ChR2), histidine kinase rhodopsin-1 (HRK1), and xanthorhodopsin (XR). Assignment of the structure was mainly accomplished by the comparison with bacteriorhodopsin (BR) spectra of states with known conformation of the retinal. ChR2 was studied both at ambient and cryogenic temperatures, using different excitation conditions to preferentially probe the dark state and the intermediates P500 and P390. Global analysis of the spectra in the C=C stretching region, using Lorentzian functions, revealed that the dark state (D470) consists of two different isomers, presumably all-trans, 15-anti and 13-cis, 15-syn, both including a protonated Schiff base, as in the case of dark-adapted BR and Rh-Bl in HKR1. The photocycle is predominantly initiated by 13-trans/cis isomerisation to afford 13-cis, 15-anti retinal in the photocycle intermediates as found for the P390 state in the slow-cycling mutant ChR2-C128S-D156A. Photoisomerisation of the 13-cis isomer of the dark state appears to be less efficient if it takes place at all. Analysis of the C=NH+ stretching modes of both dark state isomers indicate a closer proximity of a water molecule to the Schiff base bond in the case of the dark state all-trans isomer as compared to the 13-cis isomer. The photocycle of ChR2-C128T includes a side-reaction involving the reversible hydrolysis of the retinal Schiff base bond (P353). Regardless of the similarities in the fine-structured absorption pattern, the retinal configuration in P353 is not identical to a reduced and UV-treated chromophore state in BR as shown by resonance Raman spectroscopy. The retinal configuration in the dark state (Rh-UV) of the histidine kinase rhodopsin-1 (HKR1) was found to be 13-cis, 15-anti with a deprotonated RSB, similar to the M-intermediate of BR but thermally stable. Photoconversion of Rh-UV to a stable meta state (Rh-Bl) is associated with a 13-cis/trans or 15-anti/syn isomerisation resulting in two retinal isomers (all-trans, 15-anti and 13-cis, 15-syn) as identified in the resonance Raman spectra. XR contains a photoinactive carotenoid, salinixanthin, in addition to the retinal chromophore, with an absorption spectrum that largely obscures that of the retinal chromophore. Using an excitation line at the long-wavelength side of the absorption envelop identifies most of the resonance Raman bands of the retinal to an all-trans, 15-anti configuration with a protonated retinal Schiff base in accordance with most microbial rhodopsins.
