Loading…
Mit der Entdeckung der Aflatoxine in den 1960-er Jahren begann eine intensive Erforschung des Stoffwechsels der Pilze. Seitdem wurden etwa 400 verschiedene Mykotoxine identifiziert, die unter anderem ernährungsbedingte Erkrankungen wie Infektionen, Allergien und sogar Krebs begünstigen und hervorrufen können (Müller et. al S.252 (1996)). Die Nahrungsmittelkontamination durch Pilze wird häufig erst nach dem Transport zum Verbraucher sichtbar. Um gesundheitliche und finanzielle Risiken durch Verderb auszuschließen, werden Methoden für einen frühzeitigen Nachweis von lebenden filamentösen Pilzen in Nahrungsmitteln benötigt. Die Entwicklung eines derartigen Nachweises basierend auf molekularen Methoden wie zum Beispiel PCR oder RT-PCR war Aufgabe dieser Arbeit. PCR ist als Methode in der Lebensmittelanalytik weit verbreitet und wurden für den Nachweis von Pilzen in dieser Arbeit herangezogen. PCR und RT-PCR wurden mit Bezug auf die Anwendbarkeit in der Lebensmittel-Diagnostik verglichen. Da sich PCR sich dabei als die robustere Methode herausstellte war das Ziel dieser Arbeit die Entwicklung einer „real time“ PCR basierten Untersuchungsmethode zum Nachweis von lebenden filamentösen Pilzen mit Hilfe des LightCycler® PCR-Gerätes. Für die Anwendung der PCR in der Routinediagnostik waren einige Vorgaben zu beachten, wie beispielsweise die Verwendung von nicht-toxischen Substanzen in der Nukleinsäureextraktion, die Bereitstellung von hoch spezifischen und sensitiven Primern und Sonden für den Nachweis von allen lebensmittel-relevanten Arten der Pilze und eine Verringerung der für die Durchführung benötigten Zeit gegenüber herkömmlichen Verfahren der Mikrobiologie. Das pilzspezifische Gen EF-3, Elongationsfaktor 3, wurde für den Nachweis ausgewählt und bezüglich seiner Nutzbarkeit als molekularer Marker bewertet. Da zu Beginn dieser Arbeit kaum Sequenzinformationen von EF-3 aus filamentösen Pilzen verfügbar waren, wurden in dieser Arbeit Sequenzen von 101 Arten aus fast allen taxonomischen Ebenen der Pilze generiert. Der Sequenzvergleich zeigte deutlich die besonders heterogene Natur der Sequenzen aus der Gruppe der Zygomycota. Jedoch konnte diese Variabilität der Sequenzen durch die Degenerierung der Primer und Sonden erfasst werden. Verschiedene Detektionssysteme wurden im Rahmen der Entwicklung einer „Konsensus“-PCR für die „real time“ PCR getestet. Der Nachweis von spezifischen PCR Produkten mittels Sonden stellte sich als vorteilhaft heraus. Die Spezifität der ausgewählten Primer und Sonden dieser Konsensus-PCR wurde mit DNA von 165 verschiedenen Pilzstämmen positiv getestet. Die nahe verwandten Hefen wurden mit den vorgestellten Primern in 68 % und mit den Sonden in 10 % der getesteten Stämme nachgewiesen. Eine Erweiterung des Sondenspektrums zur Erfassung der Hefen in der Konsensus-PCR wird daher für eine Umsetzung in der Lebensmitteldiagnostik empfohlen. Die Sterilitäts-Testung in Lebensmitteln als eine mögliche Anwendung der Konsensus-PCR wurde in flüssigen Lebensmitteln demonstriert. Es wurde gezeigt, dass durch die Anreicherung auf Nährkarton-Membranen in Kombination mit einer effizienten DNA Extraktion und der Konsensus-PCR ein Nachweis von Pilzen noch lange vor dem Sichtbarwerden von Kolonien möglich ist. Der Ausschluss von DNA toter Zellen wird während der DNA Extraktion erreicht. Lebende Zellen können auf diese Weise gezielt nachgewiesen werden, was die Möglichkeit der Umsetzung des hier vorgestellten Systems in der Routine eröffnet.
Due to serious incidences of food and feed poisoning in the 1960’s caused by mycotoxins intensive research on the fungal metabolism began. Today about 400 different mycotoxins are known to cause food-borne diseases, allergic reaction and even cancer in humans (Müller et. al page 252 (1996)). Living filamentous fungi are also known to cause serious infection in immuno-compromised patients. Food damage caused by fungi is often invisible and late detected by change of taste and odour. Early monitoring of fungal contamination during food production can help to avoid human health risks and economical losses. A PCR based method is one possible solution for monitoring and detection of filamentous fungi in food. The aim of this work is to develop and establish a PCR based system for the detection of filamentous fungi in food by use of real time PCR in the LightCyclerÒ instrument. Industrial demands were defined in advance of this work as the employment of non-toxic substances in the nucleic acid extraction and during PCR, high specificity and high sensitivity of the primer and probe system for detection of fungal nucleic acids as well as easier and faster data acquisition compared to conventional microbiological methods. The fungal specific gene EF-3, elongation factor 3, is selected and evaluated for the usefulness as molecular marker in detection of filamentous fungi. As little sequence information is available in the public databases yet, for the first time sequence information of EF-3 from about 101 different species of nearly all taxonomic divisions of filamentous fungi was generated in this thesis. The comparison of sequences shows a heterogeneous sequence nature in Zygomycota complicating the design of universal primers and probes for PCR. Nevertheless this problem was solved by inclusion of degenerated nucleotides into the sequence design. Different primer and probe systems were investigated. A real time consensus PCR system including detection by LightCyclerÒ HybProbes was found as the best method to fulfil the industrial demands in terms of sensitivity and specificity. The specificity of the consensus PCR system is positively tested including about 165 different strains of filamentous fungi. The closed taxonomical relation between the ecological classifications yeasts and filamentous fungi implicate that yeasts are partially detected by the consensus PCR system for filamentous fungi. Indeed, exclusivity tests show around 68 % out of 56 yeast strains are cross amplified by primers and 10 % detected by probes derived from sequence information of filamentous fungi. As one application of the consensus PCR system is its use in sterility testing, it is chosen in this study to demonstrate the possibilities of PCR based methods in routine detection of viable fungi. For routine tests of viable fungi PCR and RT-PCR methods were compared and evaluated according to their practicability. PCR was confirmed as the more sensitive and robust method able to detect 3 – 30 copies of the target gene EF-3. Enrichment of filamentous fungi on nutrient pads was favoured in terms of adapting the preceding cultures to PCR based methods. The establishment of the consensus PCR system is shown by investigating fluid food samples demonstrating, that results from PCR are available before microbiological data. Differentiation between DNA from viable and non-viable cells is realized by excluding the DNA of dead cells from extraction and so finally from PCR. The main result of this work was an assay combining an efficient extraction method for DNA from filamentous fungi with a sensitive PCR system for specific amplification and detection of fungal DNA by real time PCR in the LightCyclerÒ instrument.
