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The elucidation of signalling and survival mechanisms of fungi to counteract the antifungal protein AFP

Ouedraogo, Jean-Paul

Inst. Biotechnologie

Das Protein AFP ist ein antifungal wirksames Biomolekül, welches Pilzkontaminationen und -infektionen verhindern kann. AFP ist ein amphipathisches, sekretorisches Protein des filamentösen Pilzes Aspergillus giganteus und übt eine fungizide Wirkung gegenüber einer Vielzahl von human- und pflanzenpathogenen Pilzen aus, ohne jedoch die Vitalität von Hefen, Bakterien, Pflanzen oder Säugerzellen negativ zu beeinflussen. Es wird vermutet, dass die Wirkung des AFP auf einer spezifischen Interaktion des Proteins mit pilzlichen Membranbestandteilen beruht, in deren Konsequenz die Plasmamembran von AFP-sensitiven Pilzen permeabilisiert sowie die zellwandlokalisierte Chitinsynthese blockiert wird. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden Studien durchgeführt, die zu einem Verständnis von AFP-Resistenzmechanismen führen sollten. Hierfür wurde in einem genetischen Screeningansatz verschiedene, rational ausgewählte, Genknockout-Mutanten der AFP-resistenten Hefe Saccharomyces cerevisiae auf eine mögliche veränderte AFPSuszeptibilität untersucht. Die hier gewonnenen Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass ein konzertiertes Zusammenspiel verschiedener regulatorischer Kaskaden, wie Calcium-, TOR-, cAMP-Proteinkinase A- und Zellwandintegrität-Signaling, die Grundlage für die AFPResistenz von S. cerevisiae bilden. Die Analyse der Zellwandzusammensetzung von ausgewählten Stämmen konnte zeigen, dass jene Stämme, die mit einer Erhöhung des Chitingehaltes auf AFP reagieren, eine verringerte Suszeptibilität oder sogar Resistenz bezüglich AFP aufweisen. Eine wichtige Rolle in der Chitinantwort von Hyphenpilzen können Chitinsynthasen der Klassen III und V spielen. In dieser Arbeit konnte übereinstimmend gezeigt werden, dass für die Aufrechterhaltung der Zellwandintegrität von Aspergillus niger beide Chitinsynthasen benötigt werden. Die Untersuchung entsprechender Knockout Mutanten zeigte, dass die Klasse V Mutante eine erheblich reduzierte Empfindlichkeit gegenüber AFP aufwies, die ebenfalls mit einem Anstieg des Chitingehaltes in der Zellwand korrelierte – eine Beobachtung, die in anderen Klasse V Mutanten von Hyphenpilzen (A. oryzae, Fusarium oxysporum) bestätigt werden konnte. Dies lässt vermuten, dass ein konservierter AFPResistenzmechanismus auf einem Zusammenspiel verschiedener Signalwege beruht, deren zellulärer Output eine Verstärkung der Chitinsynthese ist.
The antifungal protein (AFP) secreted by the filamentous ascomycete Aspergillus giganteus is a naturally occurring biomolecule which possesses the characteristics to combat fungal infection. AFP is a small, basic, cysteine-rich peptide which exerts extremely potent antifungal activity against human and plant pathogenic fungi without affecting the viability of bacteria, yeast, plants and mammalian cells. In the process of elucidating the antifungal protein mode of action, it has been shown that AFP disturbs membrane integrity and inhibits chitin synthesis in sensitive fungi. In order to understand how resistant fungi such as yeast cells can counteract the antifungal protein, a genetic approach has been used to screen different mutants for their sensitivity to AFP. The data gained suggest that S. cerevisiae safeguards itself against AFP via a concerted action of several different signaling pathways, such as calcium signaling, TOR signaling, cAMP-protein kinase A signaling, and cell wall integrity signaling. The analysis of the composition of the cell wall of selected strains could show that an increased chitin level can better counteract an AFP attack and that cells showing this response become less susceptible, even resistant, to AFP. Chitin synthase classes III and V play an important role in the chitin response in filamentous fungi. This work could consistently show that the maintenance of cell wall integrity of Aspergillus niger requires both chitin synthases. The examination of the corresponding knockout mutants showed that class V mutants become significantly less sensitive to AFP, which also correlates with an increased level of chitin in the cell wall; an observation which can be verified in class V chitin synthase mutants in other filamentous fungi (A. oryzae, Fusarium oxysporum). This suggests that one conserved fungal AFP resistance mechanism is based on the concerted interaction of several signaling pathways resulting in the reinforcement of the cell wall with chitin.