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Proteomische Methoden zur Identifizierung acetylierungsabhängiger Interaktionspartner von Histon H4
Lang, Diana
Die systematische Analyse von Protein-Protein-Interaktionen ist eine wichtige Voraussetzung für die Aufklärung molekularer Zusammenhänge und biologischer Funktionen innerhalb einer Zelle. Für die proteomweite Identifizierung interagierender Proteine haben sich in den letzten Jahren vermehrt Methoden durchgesetzt, die auf Affinitäts-Pulldown-Experimenten in Kombination mit quantitativer Massenspektrometrie basieren (Affinitäts-MS-Experiment). In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Ansatz, bestehend aus einer Kombination von mehrdimensionaler Peptidauftrennung mittels Flüssigchromatographie und hochaufgelöster Tandem-Massenspektrometrie, zur effektiven Identifizierung und Quantifizierung komplexer Proteingemische aus Affinitäts-Pulldown-Experimenten entwickelt. Die Methode beruht auf der Verwendung von Umkehrphasenchromatographie (RP) mit pH-sauren Elutionsbedingungen in beiden chromatographischen Dimensionen und führt durch Anwendung eines spezifischen Fraktionierungsschemas in der ersten Dimension zu einer optimalen Trenn- und somit MS/MS-Kapazität in der zweiten Dimension. Die Entwicklung und Validierung der Methodik erfolgte zunächst durch proteomweite Interaktionsanalysen mit gut charakterisierten, Tyrosin 595-phosphorylierten, Peptiden des T-Zelladapterproteins ADAP. In Kombination mit verschiedenen Isotopenmarkierungsverfahren (SILAC, enzymatische 18O-Markierung) konnten unter Anwendung der entwickelten 2-D RP-RP LC-MS/MS Methodik phosphorylierungsspezifische Interaktionspartner der ADAP-595-Peptidsequenz identifiziert werden. Im weiteren Verlauf wurde die 2-D RP-RP LC-MS/MS Methodik für die proteomweite Analyse von Interaktionspartnern des Zellkernproteins Histon H4 angewandt. Da Lysinacetylierungen generell mit einer Genaktivierung assoziiert sind, sollte insbesondere die Rolle dieser Modifizierungen als potentielle Erkennungsmotive bzw. als Werkzeug der Ladungsneutralisierung untersucht werden. Dazu wurden verschiedene acetylierte Peptide der N-terminalen Histon H4-Sequenz synthetisiert und als Matrix-gebundene Köder in differenziellen, SILAC-basierten Peptid-Pulldown-Experimenten eingesetzt. Dabei konnten additive Effekte der Histonacetylierung auf das Bindungsverhalten beobachtet werden, d.h. mit zunehmender Anzahl der Lysinacetylierungen erhöhte sich auch die Anzahl der Proteine, die nicht mehr mit dem Peptid interagierten. Darüber hinaus wurden potentielle, acetylierungsabhängige Interaktionspartner mehrfach acetylierter H4-Peptide identifiziert, wobei die Mehrzahl bekannte Chromatin- sowie RNA-Polymerase II-Interaktoren darstellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Peptid-basierte Affinitäts-MS Experimente einen wertvollen Beitrag zum Verständnis von Protein-Protein-Interaktionen leisten können.
The systematic analysis of protein-protein-interactions is a prerequisite for a comprehensive understanding of the molecular correlations within a cell and the exploration of fundamental biological functions. In recent years affinity-based pulldown experiments in combination with quantitative mass spectrometry (affinity-MS experiments) have been established to identify interacting proteins in a proteome-wide manner. In the present work, a new approach combining multidimensional peptide separations by liquid chromatography with high-resolution tandem mass spectrometry was developed and used for an efficient identification and quantification of complex protein mixtures from affinity-based pulldown experiments. The method utilizes reversed-phase (RP) capillary columns with acetonitrile-containing eluents in both chromatographic dimensions. Furthermore, by applying a specific fractionation scheme in the first dimension, samples with evenly distributed peptides were obtained, fully utilizing the separation space and MS/MS capacity in the second dimension. The well-characterized interactions of Tyr-595-phosphorylated peptides derived from the T-cell adaptor protein ADAP with SH2-domain containing proteins were used to validate this approach. Two different stable isotope labeling strategies (SILAC, enzymatic 18O-labeling) were successfully applied to identify phosphorylation-specific interaction partners of the ADAP-595 peptide. The developed 2-D RP-RP LC-MS/MS methodology was further used to analyze interaction partners of the nuclear protein histone H4 in a proteome-wide manner. Since the acetylation of specific lysine residues within the N-terminal tail regions of histones is a general means of gene activation, a possible role as recognition motif for effector proteins or simple means of charge neutralization within histone tails was the main focus of this investigations. For this reason, differentially acetylated peptides derived from the N-terminal tail of histone H4 were synthesized and served as matrix-bound baits in the following SILAC-based pulldown experiments. An additive effect of histone H4 acetylation with regard to the binding behavior was observed. An increasing number of acetylation marks resulted in a higher number of proteins that were excluded from the peptide bait. In addition, some potential acetylation-specific binding partners were recruited to multiple acetylated H4-peptides. Most of these proteins represent known chromatin- and RNA-polymerase II interactors. In summary, the results illustrate that peptide-based affinity-MS experiments provide a valuable contribution to the understanding of protein-protein-interactions.
