Loading…
Investigation of the mechanical properties of mammalian cells through dielectrophoresis
Guido, Isabella
Die mechanischen Eigenschaften und das Deformationsverhalten biologischer Zellen werden hauptsächlich durch das Zytoskelett bestimmt. Diese Eigenschaften sind eng mit vielen biophysischen und physiologischen Ereignissen der Zelle verbunden und könnten deshalb als mächtiger Biomarker dienen. In dieser Arbeit stellen wir einen neuen, vorteilhaften Technick vor, um die mechanischen Eigenschaften von Zellen zu charakterisieren: Durch die Anwendung dielektrophoretischer Kräfte werden verschiedene Typen von Zellen zwischen Mikroelektroden gedehnt. Die Untersuchungen sind in vier Teile gegliedert: Der erste Teil behandelt die komparative Anwendung unseres neu entwickelten dielektrophoretischen stretchers an Zellinien, die aus bösartigen und gutartigen Gewebe gewonnen wurden. Geringe Mengen menschlicher Zellen krebsartigen Ursprungs (MCF-7) und aus verwandtem nicht krebsartigen Gewebe (MCF-10A) reichten aus, um Ergebnisse zu erhalten, die eine eindeutige Unterscheidung dieser Zellen erlaubten. Bei der Anwendung unserer Technik auf bösartige (L-929) und gutartige (3T3) Zellen aus Mausfibroblasten beobachteten wir eine Deformationsreaktion auf das elektrischen Feld, die die an den menschlichen Zellen beobachteten Ergebnisse bestätigten. In beiden Fällen stellten sich gutartige Zellen als im Vergleich zu ihrem bösatigen Pendant weicher heraus. Eine detaillierte Analyse der dielektrischen Eigenschaften der menschlichen Zellen durch Anwendung der dielektrophoretischen Spektroskopie zeigte, dass die Unterschiede bei der Dehnung durch zellspezifische mechanische Eigenschaften und nicht durch unterschiedliche Polarisierung verursacht werden. Um aufzuklären welche Teile des Zytoskeletts der beiden Zelltypen hauptsächlich für das unterschiedliche Dehnverhalten verantwortlich sind, wurden den bösartigen und den gutartigen Zellen ein aktin- und ein mikrotubuli-spezifisches Toxin hinzugefügt. Spezifische Mikrotubulistrukturen beider Zelltypen wurden als Hauptursache für ihr Verhalten beobachtet. Der zweite Teil der Untersuchungen konzentrierte sich auf den Einfluss alterndes Kulturmediums auf die mechanischen Eigenschaften der Suspensionszellen HL-60. Unsere Experimente zeigten eindeutig, dass die Festigkeit der Zellen durch die Dauer der Kultivierung beeinflusst wird. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Veränderung der Festigkeit der HL-60 Zellen primär auf den Nährstoffabbau im Kulturmedium über die Zeit zurückzuführen waren. Im Gegensatz dazu konnte der Einfluss eines veränderten pH-Wertes als potentiell verantwortlicher Faktor für eine veränderte Deformation ausgeschlossen werden. Der dritte Teil der Arbeit befasst sich mit der Analyse der durch das elektrische Feld verursachten Erwärmung des Chips. Der Temperaturverteilung auf dem Chip, gemessen durch Infrarotthermographie und eine anschließende Berechnung des Temperaturverlaufs zeigte, dass unser System unbedeutende Temperaturerhöhungen in dem für die Experimente gewählten Spannungsbereich sowie dem elektrischen Leitfähigkeitsbereichs des Puffers, erzeugt. Die Technik ist demnach geeignet, um mit biologischen Zellen zu arbeiten. Im letzten Teil beschäftigen sich unsere Untersuchungen mit der Visualisierung der Zytoskelettstruktur während der Dehnung im elektrischen Feld. Wir benutzen eine Fluorenzenzmarkierung der Zellen durch GFP-Transfektion. Die Ergebnisse dieser Experimente demonstrieren, dass unsere Technik mit optischen Untersuchungen der internen Strukturen der Zelle voll kompatibel ist. Dies könnte die Erforschung des Verhaltens des Zytoskeletts während mechanischer Deformationen erlauben, ohne die Zelle dabei zu beschädigen. Schließlich wurde die Integration unseres dielektrophoretischen stretchers in ein Mikrofluidiksystem realisiert und in dieser Arbeit beschrieben. Unsere Technik zeigt enormes Potential für die Parallelisierung und Automatisierung und sollte sich demzufolge für hohe Durchsätze eignen, die sie für zahlreiche biomedizinische Diagnosen attraktiv machen.
The mechanical properties and the deformation behavior of biological cells are mainly determined by the cytoskeleton. These properties are closely linked to many biophysical and physiological events of the cells, and may thus be exploited as potent biomarkers. In this thesis we propose a new, advantageous approach to characterize cellular mechanical properties: Through the application of dielectrophoretic forces, different types of cells are stretched between microelectrodes. The investigations are divided into four parts. The first part deals with the comparative application of our newly developed dielectrophoretic stretcher to cell lines that have been derived from malignant and non-malignant tissues. Small numbers of human cells of cancerous origin (MCF-7) and from related non-cancerous tissue (MCF-10A) were sufficient to obtain data that allowed to unambiguously distinguish these cells. By applying our technique to malignant (L-929) and non-malignant (3T3) mouse fibroblast cells, we observed a deformation response to the electric field that confirmed the results obtained from the human cells. In both cases, nonmalignant cells turned out to be softer than their malignant counterparts. A detailed analysis of the dielectric properties of the human cells using dielectrophoretic spectroscopy showed that the differences in the stretching response are due to cell-specific mechanical properties and do not originate from differences in the polarizability. In order to deduce which parts of the cytoskeleton of the two cell types are mainly responsible for the different stretching behavior, an actin- and a microtubule-specific toxin were added to the cancerous and non-cancerous cells. Specific microtubular structures of the two cell types were identified as the major cause for the behavior observed. The second part of the investigation focuses on the influence of aging culture medium on the mechanical properties of suspension cells HL-60. Our experiments clearly showed that the cellular stiffness is influenced by the cultivation duration. The results suggested that the changes in the stiffness of the HL-60 cells were primarily attributable to nutrient depletion of the culture medium over time. In contrast, the influence of changing pH value could be excluded as a potential factor responsible for the different deformation. The third part of this work concerns the analysis of the chip heating induced by the electric field. The temperature distribution on the chip measured by using infrared thermography and a subsequent numerical calculation showed that our system produces a negligible temperature increment in the voltage and buffer electric conductivity range chosen for the experiments. The technique is thus suitable for working with biological cells. In the last part, the investigation deals with the visualization of cytoskeleton structures during stretching by the electric field. We employed fluorescent labeling of the cells through GFP transfection. The results of these experiments demonstrated that our technique is compatible with optical investigation of internal structures of the cell. This allows studying the behavior of the cytoskeleton during mechanical deformation without causing damage to the cells. Finally, the integration of our dielectrophoretic stretcher into a microfluidic system was realized and is described in this thesis. Our approach shows enormous potential for parallelization and automation and, hence, should be suited to achieve throughputs that make it attractive for numerous biomedical diagnostic purposes.
