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EPR Spectroscopic Investigation of the Active Site of [NiFe]-Hydrogenase
EPR Spectroscopic Investigation of the Active Site of [NiFe]-Hydrogenase
Foerster, Stefanie Anette Erica
Fak. 2 Mathematik und Naturwissenschaften
Hydrogenasen katalysieren die reversible Oxidation von Wasserstoff zu Protonen. Diese Metalloenzyme spielen eine bedeutende Rolle im Energiestoffwechsel vieler Organismen. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit war die Aufklärung der elektronischen und molekularen Struktur des aktiven Zentrums in seinen verschiedenen paramagnetischen Redoxzuständen, die mit Ni-A, Ni-B, Ni-C und Ni-L bezeichnet werden. Für ein tiefergehendes Verständnis des Katalysemechanismus' ist die Lokalisation des Wasserstoffes in der Umgebung des aktiven Zentrums von Bedeutung, da diese Daten nicht durch Methoden der Röntgenstrukturanalyse zugänglich sind. Mit Hilfe der verschiedenen Methoden der Elektronen-Paramagnetischen-Resonanz (EPR) Spektroskopie konnten die Antworten auf diese Fragestellung gefunden werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Standard [NiFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F und die regulatorische [NiFe]-Hydrogenase aus Ralstonia eutropha untersucht. Nach den bisher bekannten Ergebnissen biochemischer und biophysikalischer Untersuchungen sind die Übergangsmetallcluster dieser beiden Hydrogenasen sehr ähnlich aufgebaut: Sie bestehen beide aus einem heterobimetallischen Nickel-Eisen-Zentrum, das durch vier Cysteine an die Proteinmatrix verankert ist und am Eisen ausserdem durch drei anorganische Liganden koordiniert wird. Diese Tatsache erlaubt den direkten Vergleich dieser beiden Enzyme, trotz ihrer physiologisch unterschiedlichen Aufgaben. Der g-Tensor des aktiven Zentrums läßt direkte Rückschlüsse über dessen elektronische Struktur zu. In dieser Arbeit wurden die g-Tensor Orientierungen der Hydrogenase aus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F im Ni-C und im Ni-L Zustand mit Einkristall-EPR Untersuchungen bestimmt. Die ausgezeichnete Achse des Tensors, g3, bleibt im Vergleich zu den oxidierten Zuständen sowohl im Ni-C Zustand als auch Ni-L Zustand weitestgehend erhalten, trotz der stark unterschiedlichen g-Tensorhauptwerte des Ni-L. Die g1 und g2 Achsen sind jedoch im Ni-C und Ni-L Zustand gegenüber den oxidierten Zuständen vertauscht. Die Grundzustände von Ni-C und Ni-L werden, wie auch von Ni-A und Ni-B, am besten durch einen formalen 3dz² Grundzustand beschrieben, dessen Vorzugsrichtung durch g3 gekennzeichnet ist. Im Ni-L Zustand ist jedoch ein nicht zu vernachlässigender Teil der Spindichte auf das 3dx²-y² Orbital verschoben. Mit Hilfe von 61Ni Isotopenmarkierungen konnten die Hauptwerte der Hyperfeinkopplungen der Ni-A, Ni-B, Ni-C und Ni-L Zustände der Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F Hydrogenase bestimmt werden. Die Grösse der Hyperfeinaufspaltung weist auf eine starke Delokalisation der ungepaarten Spindichte auf die Liganden in allen untersuchten Zuständen hin. Hyperfine sublevel correlation-(HYSCORE)-spektroskopische Untersuchungen an der H/D-ausgetauschten Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F Hydrogenase zeigten, dass im Ni-B Zustand der äquatoriale Brückenligand protoniert ist. Die Ergebnisse der 17O Austauschexperimente deuten darauf hin, dass es sich hier um ein Hydroxid- und nicht wie bisher vermutet, um einen Sulfhydrylliganden handelt. Ausserdem wurden die vollständigen Hyperfein- und Quadrupolkopplungstensoren des N(?) von His88, einer Aminosäure die relativ nah am aktive Zentrum gebunden ist, für Ni-A und Ni-B bestimmt. Im Ni-C Zustand konnte erstmals der komplette Hyperfeintensor des stark anisotrop gekoppelten H/D austauschbaren Substratwasserstoffs (Hydrids) für eine Standard [NiFe]-Hydrogenase mit Hilfe von HYSCORE Spektroskopie bestimmt werden. Als Bindungsort wurde die verbrückende Position zwischen dem Nickel und dem Eisen bestimmt. Genau dieses Hydrid wird durch Beleuchtung der Probe abgespalten, was mit den entsprechenden HYSCORE spektroskopischen Untersuchungen bewiesen werden konnte. Durch Analyse von orientierungsselektierten ENDOR Spektren des Ni-C und Ni-L Zustandes der Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F Hydrogenase konnten Hyperfeintensoren zu Protonen der Cysteinliganden zugeordnet werden. Die Richtungen und die Grössen der Hyperfeintensorhauptwerte im Ni-C Zustand sind dabei denen des oxidierten Zustandes sehr ähnlich. Im Ni-L Zustand hingegen sind die experimentell bestimmten Hyperfeinkopplungskonstanten in Richtung des 3dz² Orbitals stark verkleinert. Dieser Befund zeigt, dass der Ni-L Zustand einen grösseren Anteil an 3dx²-y² Orbitalspindichte besitzt als die anderen untersuchten Zustände. Der ebenfalls untersuchte Ni-L Zustand der Ralstonia eutropha Hydrogenase zeigt ein dazu analoges Verhalten.
Hydrogenases catalyze the reversible oxidation of molecular hydrogen and play a vital role in anaerobic metabolism of a wide variety of microorganisms. This work focuses on the elucidation of the electronic and molecular structure of the active site of [NiFe]-hydrogenases in its various paramagnetic redox states, termed Ni-A, Ni-B, Ni-C, and Ni-L, respectively. In order to understand the catalytic mechanism the localization of hydrogen in the vicinity of the active site is of crucial interest. Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is a unique tool to determine the structure of such paramagnetic species because it directly focuses on the unpaired electrons and their closest vicinity. In this work the standard hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F and the regulatory hydrogenase from Ralstonia eutropha have been examined by means of paramagnetic resonance spectroscopy. According to earlier biochemical and biophysical studies the active site transition metal clusters share highly similar structures: In both enzymes they consist of a heterobimetallic nickel-iron center that is attached to the protein by four cysteinates with the iron being coordinated by three further inorganic ligands. This similarity facilitates direct comparison of the two enzymes despite their different physiological tasks. The g-tensor of the active site allows to draw conclusions from the electronic structure. In this work the g-tensor orientation of the hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F in the Ni-C and Ni-L state have been determined by single crystal EPR studies. The orientation of the g3-tensor axis in the Ni-C state as well as in the Ni-L state remain similar to that of the Ni-A and Ni-B states even though the respective g-tensor principal values are quite different. However, the orientations of the g1- and g2-tensor axes of the Ni-C and the Ni-L state are interchanged with respect to Ni-A and Ni-B. The electronic ground states of Ni-C and Ni-L are best described by a formal 3dz² with its direction along the g3-axis. In the Ni-L state, however, an additional admixture of 3dx²-y² to the ground state is found. 61Ni labeling of the hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F allowed to determine the magnitudes of principal values of the hyperfine coupling tensors for the Ni-A, Ni-B, Ni-C, and Ni-L states. According to the absolute values of the observed couplings it was shown that considerable part of the spin density is delocalized on the ligand atoms. From the Hyperfine sublevel correlation (HYSCORE) spectra of the oxidized Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F hydrogenase in the Ni-B state the complete hyperfine tensor of a H/D exchangeable hydron was determined. These data revealed that in the Ni-B state the equatorial bridging ligand is protonated. Results of 17O exchange experiments indicated that the ligand rather constitutes a hydroxide than a sulfhydryl ligand, which was proposed earlier. Furthermore the complete hyperfine and quadrupole tensors of N(?) of His(88) which is an amino acid in the close vicinity of the active site have been determined for the Ni-A and Ni-B state. Analysis of 1,2H-HYSCORE spectra of the catalytically active Ni-C state of the Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F hydrogenase after H/D solvent exchange yielded the complete hyperfine tensor of a hydron that is located in the bridging position between the nickel and the iron. By means of HYSCORE studies it has been shown that in the Ni-L state of the standard hydrogenase the H/D exchangeable hydron is cleaved off by illumination. By interpretation of orientation selected ENDOR spectra of the hydrogenase in the Ni-C and Ni-L state proton hyperfine tensors were determined. These were assigned to ?-CH2 protons of the coordinating cysteine residues, namely to protons of the bridging Cys549 and of the terminal Cys546. The orientations and the magnitudes of the tensors of the Ni-C state are quite similar to those of the oxidized states. In the Ni-L state the experimentally determined hyperfine tensors in the direction of the 3dz² orbital are considerably decreased. This result shows that Ni-L carries a larger contribution of 3dx²-y² spin density than the other states. The Ni-L states of the Ralstonia eutropha hydrogenase exhibit an analogous decrease of the hyperfine couplings upon conversion from Ni-C.
