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Über Nebenprodukte von D-Galactose in Abhängigkeit von ihrer Herstellung
Baumgart, Sabine
Galactose kann verschiedene Verunreinigungen aus ihrem Herstellungsgang enthalten. Sechs Chargen von pharmazeutischer Qualität (A-F) wurden auf Spuren niedermolekularer und nichtflüchtiger Verunreinigungen untersucht. Einige Nebenprodukte, die in bereits bekannten Abbaureaktionen beschrieben worden waren, wurden im Rahmen dieser Arbeit in einigen vorhandenen Zwischenprodukten der Hersteller A-C nachgewiesen. Das Hauptanliegen dieser Arbeit war aber, nach Auffindung von Leitsubstanzen deren Bildungswege zu diskutieren und so Rückschlüsse auf technologische Teilprozesse innerhalb der jeweiligen Herstellungsverfahren für Galactose zu ziehen. Die Bedeutendsten wurden dazu einführend beschrieben. Da nach der Galactose-Gehaltsbestimmung mit Hilfe eines HPLC- und eines enzymatischen Verfahrens nur höchstens ein Gewichtsprozent an Verunreinigungen zu erwarten war, wurden geeignete Analysenmethoden bzw. Probenaufarbeitungstechniken ausgewählt und weiterentwickelt, die einen Nachweis von Verunreinigungen im Spurenbereich zulassen Für den Nachweis von Kohlenhydraten kam neben der MALDI-TOF-MS, DC, HPLC/RI vor allem die HPAEC/PED als Analysenmethode zum Einsatz. Dabei wurden neben 6-O-ß-D-Galactopyranosyl-D-galactose, die als Transgalactosylprodukt der ß-Galactosidase und damit als Leitsubstanz für die enzymatische Lactosehydrolyse beschrieben wurde (A und B), fünf Verunreinigungen (1-5) in spezifischen Mengenverhältnissen in vier Galactosen beobachtet. Für die Strukturuntersuchung dieser nichtflüchtigen Verbindungen wurde nach deren dünnschichtchromatographischer Isolierung ihre reduktive Spaltung und Messung mittels GC/MS eingesetzt. Die Strukturuntersuchungen ergaben jeweils überlagerte Disaccharide aus Glucose- und Galactosemonomeren in folgenden Mengenverhältnissen: Gal-Gal : Gal-Glu : Glu-Gal = 1 : 1,2 : 1,4. Die Auftrittshäufigkeiten und Differenzierungen der Bindungspositionen konnte durch folgende Reihenfolge angegeben werden: 6 Gal (Pyr + Fur; 47 %) > 6 Glu (Pyr + Fur; 23 %) > 2 Gal (Pyr; 9 %) > 3 Gal (Pyr; 9 %) > 4 Glu (Pyr; 6 %) > 2 Glu (Pyr; 5 %) > 4 Gal (Pyr; 1 %). Diese als Reversionszucker diskutierten Verbindungen waren zusammen mit dem Nachweis von 5-Hydroxymethyl-2-furfural, das mit Hilfe von HPAEC/UV bestimmt wurde, und 1,6-Anhydro-ß-D-galacto- und -glucopyranose charakteristisch für die Durchführung einer säurekatalysierten Lactosehydrolyse in den Chargen C, D und F. Organische Säuren wurden mit Hilfe der HPICE und HPIC mit Leitfähigkeitsdetektion und einer geeigneten Suppressortechnik bestimmt. Zur Absicherung der Ergebnisse wurde in ausgewählten Fällen die spezifische enzymatische Analyse durchgeführt und ihre Ergebnisse diskutiert. Zur Ergänzung wurde die GC/MS und RP-HPLC mit Fluoreszenzdetektion nach Derivatisierung in ausgesuchten Fällen herangezogen. Aus dieser Substanzklasse sind vor allem Zitronen-, L-Äpfel- und Bernsteinsäure zu nennen, die als Intermediate des Zitratzyklus zusammen mit Glycerin als Nebenprodukt und Phosphat als Hauptmineralstoff der Hefe einen Hinweis auf die Glucosevergärung während des Galactoseherstellungsprozesses in den Chargen A, B, C und D gaben. Das Retentionsverhalten der vorkommenden anorganischen Anionen und aliphatischen Carbonsäuren war auf den Anionenaustauschern sehr ähnlich, so dass diese miterfaßt wurden. Ausgewählte Kationen wurden mit Hilfe der Flammenphotometrie und AAS bestimmt. Es gelang, jeweils anhand weniger charakteristischer Substanzen den Werdegang der angewandten Galactoseherstellungsverfahren zu rekonstruieren. Daneben wurde der Mechanismus der Entstehung der Nebenprodukte diskutiert.
